■管軍軍 張?zhí)煊?董 玲 王志祥

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧學(xué)博士后科研流動站，河南鄭州450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南鄭州450001；3.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機械研究所有限公司，遼寧沈陽110036）

近年來，一些研究工作者提出利用生物發(fā)酵的方法來解決仔豬配合飼料設(shè)計與生產(chǎn)中存在的一些問題：纖維素或木質(zhì)素含量過高，含有抗原性蛋白，添加劑未合理使用等問題[1-2]。篩選一種或幾種益生菌降解飼料中纖維素、抗原蛋白為低聚糖、小肽等營養(yǎng)物質(zhì)，同時微生物代謝產(chǎn)生各種酶、活性物質(zhì)有利于仔豬的消化吸收[3-4]。

目前，發(fā)酵飼料研究與生產(chǎn)主要以固態(tài)發(fā)酵為主，從生物反應(yīng)過程中的本質(zhì)考慮，固態(tài)發(fā)酵最顯著的特征就是水分活度低，菌體生長、物質(zhì)吸收、產(chǎn)物分泌等具有不均勻性，導(dǎo)致體系中物質(zhì)傳遞具有不連續(xù)性，使得發(fā)酵過程的各種參數(shù)的精確控制比較困難[5]。為解決上述過程控制問題，科研工作者常常從固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)上進(jìn)行研究[6]。當(dāng)然，不同的固態(tài)發(fā)酵體系，其動力學(xué)的數(shù)學(xué)模型不同，因此，迄今為止,仍未見到較為完善的有關(guān)適用大部分固態(tài)發(fā)酵過程的數(shù)學(xué)模型的報道[5]。

對此，本課題組結(jié)合固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的產(chǎn)業(yè)化實際情況，在前期系統(tǒng)研究前處理工序、單菌種發(fā)酵工藝及菌種組合的基礎(chǔ)上，本研究主要集中單菌種(枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌)及其混菌組合（雙菌種和三菌種）的固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)的研究，為固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的過程控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

枯草芽孢桿菌BS-GA15購自潤盈生物工程（上海）有限公司；酵母和乳酸菌為河南工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；上述各菌種經(jīng)過篩選馴化后，并加以輔料經(jīng)冷凍干燥制成發(fā)酵劑（＞108CFU/g），冰箱5℃保存?zhèn)溆?。仔豬配合飼料551H及552H由河南廣安生物科技股份有限公司生產(chǎn)，其組成如表1所示；另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱，上海瑯玕實驗設(shè)備有限公司；JJ-CJ-1FD超凈工作臺，吳江市凈化設(shè)備總廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004B電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 粗蛋白的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432—1994對仔豬配合飼料或發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行粗蛋白的測定。

1.4 發(fā)酵試驗

將菌種發(fā)酵劑接種到培養(yǎng)液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，置于30℃條件下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)4 h。取發(fā)酵劑活化液一種（單菌種發(fā)酵）或幾種（混菌發(fā)酵）接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[仔豬配合飼料551H或552H與蒸餾水(6∶4)組成，裝料100 g/瓶]上，總接種量為5%，混菌發(fā)酵各菌種比例利用前期研究的結(jié)果[7]選擇最佳配比，具體見表2所示。攪拌均勻后，置于培養(yǎng)箱中30℃固態(tài)發(fā)酵，一定時間后取樣，50℃條件下干燥成品備用。所有試驗處理均重復(fù)3次。

表1 仔豬配合飼料551H及552H配方

表2 混菌發(fā)酵最佳菌種配比

1.5 動力學(xué)計算

通常，描述生物質(zhì)變化與時間相互作用的方程有Logistic（邏輯）、指數(shù)及線性方程[8]，數(shù)學(xué)表達(dá)為：

式中：X——生物質(zhì)的濃度，本研究中指蛋白濃度(%)；

X0——0時間點X值(%)；

K——生長率(%/h)；

μ——生長率常數(shù)(h-1)；

Xm——承載力(%)。

使用軟件Polymath（6.0版）線性和非線性回歸模塊擬合方程（1）～（3），相關(guān)系數(shù)R2判斷方程與數(shù)據(jù)相關(guān)性，均方根偏差（Rmsd）評估擬合度。

1.6 統(tǒng)計方法

利用SAS 9.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌種發(fā)酵

圖1 單菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料蛋白的變化

單菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬發(fā)酵配合飼料過程中，飼料蛋白含量的變化隨著菌種不同而有所不同，而且不同的固態(tài)培養(yǎng)基，其結(jié)果也不相同(見圖1)，但是發(fā)酵時間對于蛋白質(zhì)含量的影響是非常顯著的(551H：P=0.000 3＜0.01；552H：P＜0.000 1)。具體來說，對于551H(見圖1A)，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白含量開始上升，24 h后，酵母與乳酸菌發(fā)酵所得產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量開始下降，而枯草芽孢桿菌則在32 h后則出現(xiàn)下降，40 h后，三種菌發(fā)酵的產(chǎn)品蛋白含量均出現(xiàn)小幅上漲；對于552H(見圖1B)，在所研究的發(fā)酵時間內(nèi)，酵母與乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量基本處于上升態(tài)勢，而枯草芽孢桿菌呈先升(＜32 h)后降(＞32 h)的態(tài)勢。

為了進(jìn)一步研究各菌種的發(fā)酵過程中飼料中蛋白變化態(tài)勢，需要從動力學(xué)方程進(jìn)行擬合分析。單菌種固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)方程的擬合參數(shù)如表3所示。對于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵551H或552H，三種動力學(xué)方程的擬合結(jié)果中R2及Rmsd比較接近，因此這三種動力學(xué)方程均可描述該菌種的固態(tài)發(fā)酵過程，實際應(yīng)用中線性方程應(yīng)比較方便；但是，固態(tài)發(fā)酵552H過程所得擬合方程的R2＜0.8較551H低，因此，模型與實際數(shù)據(jù)的相關(guān)性較551H低，那么所擬合的動力學(xué)方程能更好地反應(yīng)枯草芽孢桿菌對于551H的固態(tài)發(fā)酵過程。對于酵母或乳酸菌，在固態(tài)發(fā)酵551H過程中，Logistic方程的R2較大且Rmsd較小，故該動力學(xué)方程適合描述這兩種菌種的發(fā)酵過程；而552H的固態(tài)發(fā)酵過程中，針對酵母或乳酸菌所擬合的各動力學(xué)方程中R2及Rmsd較為接近，因此，Logistic方程適合描述酵母和乳酸菌對于551H的固態(tài)發(fā)酵過程，而三種方程均可描述酵母和乳酸菌對于552H固態(tài)發(fā)酵過程。

表3 單菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料動力學(xué)方程擬合參數(shù)

2.2 雙菌種混菌發(fā)酵

對于所研究的雙菌種混菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料，時間在該發(fā)酵過程中，對于產(chǎn)品蛋白的變化仍然影響非常顯著（P＜0.000 1），如圖2所示。具體來說，對于551H的固態(tài)發(fā)酵過程，蛋白變化基本上處于先升后趨于平緩的態(tài)勢（見圖2A）；而于552H的固態(tài)發(fā)酵過程，12 h內(nèi)，變化平緩，超過12 h，蛋白變化趨于緩慢上升中(見圖2B)。

圖2 雙菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料蛋白的變化

對于試驗結(jié)果進(jìn)行擬合所得動力學(xué)數(shù)據(jù)如表4所示。對于551H，各組合的擬合結(jié)果中，Logistic方程R2均在0.9以上，較其它兩種動力學(xué)方程大，且Rmsd較小；對于552H，B+L(1∶1)與S+L(1∶1)擬合結(jié)果中各方程的R2均在0.9以上且Rmsd較小，而B+S(1∶2)僅Logistic方程的R2在0.9以上；因此，Logistic方程較為適合描述雙菌種固態(tài)發(fā)酵551H及B+S(1∶2)固態(tài)發(fā)酵552H過程，而三種動力學(xué)方程均適合描述B+L(1∶1)及S+L(1∶1)固態(tài)發(fā)酵552H過程。

表4 雙菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料動力學(xué)方程擬合參數(shù)

2.3 三菌種發(fā)酵

三菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料過程中蛋白的變化如同圖3所示，時間仍然是其非常顯著的影響因素（P=0.000 1＜0.01），而且蛋白的變化基本呈上升態(tài)勢。經(jīng)過對試驗結(jié)果進(jìn)行動力學(xué)方程擬合可知(表5)，對于551H，三菌種發(fā)酵過程所擬合的Logistic與線性方程R2在0.9以上且Rmsd較?。欢鴮τ?52H，擬合方程R2均在0.9以上且Rmsd較小；因此，Logistic與線性方程可較好地描述三菌種固態(tài)發(fā)酵551H過程，而三種動力學(xué)方程均可較好地描述三菌種固態(tài)發(fā)酵552H過程。

2.4 討論

動力學(xué)方程是生化反應(yīng)過程中生物質(zhì)的形成與時間關(guān)系的數(shù)學(xué)描述，從而可通過反應(yīng)時間控制目標(biāo)產(chǎn)物生成與變化，一定條件下，有效解決了生化反應(yīng)復(fù)雜性對于產(chǎn)物的影響及在線監(jiān)控指標(biāo)等相關(guān)應(yīng)用問題[6]。本研究中，由于飼料中蛋白作為一個主要組成部分，且參與發(fā)酵過程，因此，其變化能較好地反應(yīng)固態(tài)發(fā)酵過程，所以，用蛋白的變化作為本研究的目標(biāo)生物質(zhì)的變化是合理的。通常，描述生物質(zhì)變化的方程有三種：Logistic、指數(shù)及線性方程。按其復(fù)雜程度來說，Logistic方程最為復(fù)雜，但是能描述生物質(zhì)的復(fù)雜變化，指數(shù)方程次之，而線性方程最為簡單，并且應(yīng)用方便。不論是哪一種方程，只要在一定條件下所擬合的參數(shù)與目標(biāo)產(chǎn)物的變化存在相當(dāng)高的相關(guān)性，擬合度較高，那么，該擬合方程對目標(biāo)產(chǎn)物的變化與控制就有指導(dǎo)意義。

圖3 三菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料蛋白的變化

統(tǒng)計學(xué)上，對于擬合方程的評價一般用R2及Rmsd來描述：R2較大且Rmsd較小，則所得方程與數(shù)據(jù)有很高的相關(guān)性與擬合度。R2＞0.7(R＞0.8)，具有較好的相關(guān)性；R2＞0.81(R＞0.9)，相關(guān)性很高；R2＞0.9(R＞0.95)，相關(guān)性非常高；至于R2＜0.7，一般認(rèn)為相關(guān)性不高，不可接受。Rmsd越小，擬合度越高，通常R2較大則Rmsd較小。本次研究中，只有酵母與乳酸菌對于551H的固態(tài)發(fā)酵過程所擬合的指數(shù)與線性方程，R2＜0.7（表3），因此，這兩種微生物固態(tài)發(fā)酵551H過程不能用指數(shù)與線性方程描述。而其它所研究的固態(tài)發(fā)酵過程所得到的擬合方程R2＞0.7，這三種動力學(xué)方程均適用。

表5 三菌種固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料動力學(xué)方程擬合參數(shù)

另一方面，即使在R2＞0.7的情況下，或者對于本研究的所有固態(tài)發(fā)酵過程（圖1～圖3），發(fā)現(xiàn)同一過程的三種動力學(xué)方程的擬合結(jié)果中，擬合的Logistic方程具有最高的R2及最小的Rmsd（表3～表5），說明Logistic方程雖然復(fù)雜，但是非常適合描述固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料過程。這也反應(yīng)出固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，若想精確控制該發(fā)酵過程，Logistic方程是一個較為合適的方法。

本研究結(jié)果是對0～48 h內(nèi)所得數(shù)據(jù)的擬合方程，因此，該結(jié)果對于相關(guān)條件下48 h內(nèi)固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料有較好的指導(dǎo)作用。另外，在控制精度不高的情況下，除酵母與乳酸菌固態(tài)發(fā)酵551H外，線性方程是一個較好的選擇，能較好地描述大多數(shù)固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料過程。

3 結(jié)論

單菌種(枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌)及其混菌組合（雙菌種和三菌種）的固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的動力學(xué)研究表明：

①發(fā)酵時間對于固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響非常顯著（P＜0.01）；

②單菌種固態(tài)發(fā)酵過程動力學(xué)：酵母和乳酸菌固態(tài)發(fā)酵551H過程只能用Logistic方程描述（R2＞0.9），其它發(fā)酵過程均可用Logistic方程、指數(shù)及線性方程描述（R2＞0.7）；

③混菌固態(tài)發(fā)酵過程均可用Logistic方程、指數(shù)及線性方程描述[雙菌種（R2＞0.7）和三菌種（R2＞0.9）]；

④Logistic方程可以較為精確地描述固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料過程[單菌種(R2＞0.7)，混菌(R2＞0.9)]，而線性方程能較好地描述大多數(shù)固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料過程(R2＞0.7)。

本研究結(jié)果將為固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的過程參數(shù)與在線控制提供一定的理論支撐與指導(dǎo)。