楊 琳，李玉容，張 武，朱 丹

（大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

白及Bletilla striata（Thunb.）Rchb.f.為蘭科白及屬多年生草本植物，白及干燥塊莖別名良姜、紫蘭。白及在我國主要分布于江西、江蘇、甘肅、陜西、四川、云南等地〔1-2〕，其中在云南的分布比較廣泛，主要集中分布在文山、曲靖、昆明、玉溪、紅河等地區(qū)。白及塊莖為我國傳統(tǒng)中藥，可用于治療咳血、潰瘍疼痛、燙傷灼傷、手足皸裂、肺結(jié)核、百日咳、食管炎、鼻竇炎、血管瘤等疾病〔3〕。白及還被譽(yù)為“美容仙子”，具有美白祛斑、除皺等美容功效，可作為粘稠劑、保濕劑和助乳化劑等用在化妝品中〔4〕。

白及種子在自然野生環(huán)境中很難萌發(fā)〔5〕，目前主要依靠鱗莖進(jìn)行繁殖，不僅繁殖率低，供不應(yīng)求，而且消耗了很多的鱗莖。傳統(tǒng)的人工栽培通常采用分株繁殖，其繁殖率較低、周期長，不適宜用于商業(yè)化的規(guī)模種植，無法滿足市場需求，白及現(xiàn)已被列為中國30種稀缺瀕危天然藥物之一〔6〕?，F(xiàn)已有很多學(xué)者在白及的組織培養(yǎng)技術(shù)，主要針對不同成熟度的白及種子的無菌萌發(fā)〔7-9〕、原球莖的生長發(fā)育〔10〕、無菌苗生長激素的篩選〔11〕以及最適合生根的相關(guān)激素配比等方面展開了研究。目前對白及種子的組織培養(yǎng)研究尚少，本實(shí)驗(yàn)采用人工栽培和人工授粉的種子為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，采用正交試驗(yàn)，從培養(yǎng)條件、激素配比、有機(jī)物添加劑對白及的組織培養(yǎng)進(jìn)行探索，希望能初步建立起白及組織培養(yǎng)繁殖體系，可以在短時間內(nèi)獲得大量無菌種苗滿足市場需求，為白及的組培快繁及產(chǎn)業(yè)化栽培提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)用材料選自云南人工栽培的成熟飽滿的白及蒴果。

1.2 方法

1.2.1 種子的春化處理 將成熟的白及蒴果置于4℃的冰箱中保存4 d，打破種子的休眠期，便于種子萌發(fā)。

1.2.2 蒴果滅菌與種子接種 成熟未裂開的白及蒴果表面先用洗衣粉水刷洗，再用流水沖洗蒴果約30 min。待表面水分被無菌濾紙吸干后先用75%酒精消毒1 min，再用0.1%的升汞溶液浸泡15 min〔12〕，期間不停搖動。消毒徹底后用無菌水沖洗4～6遍，無菌濾紙吸干表面水分后在無菌條件下用手術(shù)刀切開蒴果頂部，用鑷子將粉末狀種子直接抖落在培養(yǎng)基上，稍加搖動，使種子散布均勻，盡量鋪滿培養(yǎng)基表面。

1.2.3 白及種子的無菌萌發(fā) 以MS和1∕2MS為基本培養(yǎng)基，MS和1∕2MS培養(yǎng)基母液的配制及保存參考文獻(xiàn)〔13〕的方法。添加蔗糖30 g∕L，瓊脂9 g∕L以及不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑6-芐氨基腺嘌呤（6-BA），6-BA添加量見表1，pH 5.8，每種處理接種10瓶，分別置于光照培養(yǎng)室及暗培養(yǎng)室培養(yǎng)。

表1 白及種子萌發(fā)的不同培養(yǎng)基

1.2.4 白及無菌苗的增殖 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用L9（34）正交試驗(yàn)研究3種對植物生長發(fā)育有重要作用的植物生長調(diào)節(jié)劑：6-BA、萘乙酸（NAA）、激動素（KT）對白及無菌苗增殖的影響，正交試驗(yàn)各因素及水平見表2。每種處理接種10瓶，每瓶接種3株2 cm左右的種子萌發(fā)無菌幼苗（切除根），分別于光照培養(yǎng)室及暗培養(yǎng)室培養(yǎng)。

表2 白及無菌苗增殖試驗(yàn)因素水平

1.2.5 白及無菌苗的生根培養(yǎng) 由于白及生根主要受NAA、赤霉酸（GA3）、番茄汁等因素的影響，為了研究白及無菌苗最佳生根培養(yǎng)條件，實(shí)驗(yàn)以1∕2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用L9（34）正交試驗(yàn)方法探討NAA、GA3、番茄汁等2種植物生長調(diào)節(jié)劑及1種天然復(fù)合物對白及無菌苗生根的影響，正交試驗(yàn)各因素及水平見表3。每種處理接種10瓶，每瓶接種2株5 cm左右的無根幼苗。接種后的培養(yǎng)瓶放置到光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d時記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表3 白及無菌苗生根試驗(yàn)因素水平

1.2.6 培養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)涉及的種子無菌萌發(fā)、無菌苗增殖及生根培養(yǎng)的光照培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光周期12 h∕d；暗培養(yǎng)條件為全天無光照，溫度（25±1）℃。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析方法 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合方差對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 不同實(shí)驗(yàn)處理對白及種子萌發(fā)的影響種子萌發(fā)過程中，按表1光照處理1、4種子形態(tài)變化明顯，種子首先吸水膨脹，約5 d后種胚細(xì)胞開始分裂，橢圓形種子體積明顯增大；約13 d后突破種皮萌發(fā)出許多綠色的芽點(diǎn)，且處理4的長勢比處理1的長勢好，而此時暗處理種子均沒有明顯變化；20 d后暗處理1、4種子形態(tài)開始有所改變，而暗處理2、3、5、6種子表面顏色仍未見明顯變化，將其全部轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)25 d后，處理1、4中的小苗長出3片葉子，其他處理也可見萌發(fā)跡象，出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。2個月后，1∕2MS培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基中的無菌苗高度相差不大，但MS培養(yǎng)基中有部分無菌苗出現(xiàn)枯萎及生長不良的現(xiàn)象，表明1∕2MS培養(yǎng)基種子萌發(fā)效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基。這主要是因?yàn)镸S培養(yǎng)基中鹽溶液較1∕2MS培養(yǎng)基高，高濃度的鹽溶液對白及種子萌發(fā)會產(chǎn)生一定的毒害作用，1∕2MS培養(yǎng)基鹽分濃度相對較低，比較溫和，有利于萌發(fā)〔14〕，故選用1∕2MS培養(yǎng)基作為種子萌發(fā)的基本培養(yǎng)基。

結(jié)合6-BA添加量及光照條件等因素分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-BA會抑制白及種子的萌發(fā)，因此不加任何激素的1∕2MS培養(yǎng)基結(jié)合適當(dāng)光照條件更有利于白及種子的萌發(fā)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與宋曉丹等〔15〕的研究結(jié)果基本相似。但是袁寧等〔16〕通過對比1∕2MS培養(yǎng)基與1∕2MS+6-BA 1.0 mg∕L培養(yǎng)基認(rèn)為6-BA有利于白及種子萌發(fā)，因此對于6-BA對白及種子萌發(fā)的影響還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 不同激素配比對無菌苗增殖的影響按照正交試驗(yàn)的方法，將2 cm左右無根的無菌苗接種到增殖培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)13 d左右其基部開始膨大，分化出原球莖，無菌苗也緩慢長高，并變得粗壯，顏色濃綠。隨著培養(yǎng)時間的延長，原球莖上開始出現(xiàn)小芽點(diǎn)，并慢慢長成叢生芽，在培養(yǎng)40 d后對新生芽進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，NAA濃度（0.05 mg∕L）較低時有利于無菌苗叢生芽的誘導(dǎo)，6-BA和KT對叢生芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，且對白及無菌苗增殖影響的主次順序?yàn)椋篘AA＞KT＞6-BA。誘導(dǎo)白及無菌苗增殖的較適組合為MS+6-BA 1.00 mg∕L+NAA 0.05 mg∕L+KT 1.00 mg∕L，此時白及無菌苗增殖系數(shù)達(dá)到1.83。但結(jié)合方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-BA、NAA和KT的F值均＜F0.05（2，8），即P＞0.05，表明各激素濃度變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此激素對于無菌苗增殖的具體影響還需要更深入的研究。見表5。

表4 不同激素對無菌苗增殖的影響

表5 不同激素對無菌苗增殖影響結(jié)果方差分析

2.3 不同濃度的添加劑對無菌苗生根的影響NAA屬于植物生長調(diào)節(jié)物中的生長素類，可促進(jìn)植物根系的分化，常用于植物組織培養(yǎng)以促進(jìn)無菌苗的生根培養(yǎng)。番茄汁中含有大量的糖類，可為植物細(xì)胞分裂分化提供碳源，為植物生根提供所需營養(yǎng)物質(zhì)。番茄汁中還含有豐富的維生素C和維生素B，可促進(jìn)外植體的生長和芽的生長。此外，番茄汁加入培養(yǎng)基中可使培養(yǎng)基顏色變深，為無菌苗的生根提供了暗環(huán)境，有利于根的生長。GA3可促進(jìn)幼芽的生長，利于根莖的伸長，當(dāng)GA3與番茄汁共同作用可促使植株生長健壯，根系發(fā)達(dá)，有利于移栽和煉苗。將4 cm左右的白及無根苗按正交試驗(yàn)方法接入生根培養(yǎng)基中，10 d左右可看到小苗的基部開始長根，培養(yǎng)35 d后，拔出小苗進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NAA 1.0 mg∕L生根效果好，生根率高，每株試管苗生根數(shù)多。當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.5 mg∕L時，對生根有一定的抑制作用，生根率降低，根系出現(xiàn)卷曲細(xì)小現(xiàn)象，根外部出現(xiàn)畸形。結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，NAA對白及無菌苗生根影響最大，番茄汁次之，GA3影響最小。誘導(dǎo)生根的最佳組合為1∕2MS+NAA1.0mg∕L+GA31.5mg∕L+番茄汁200g∕L，此時生根率達(dá)100%，但根部粗壯卷曲，苗枯萎嚴(yán)重。這是因?yàn)榉阎?，使培養(yǎng)基pH降低，在調(diào)節(jié)pH過程中加入過多的堿，改變了培養(yǎng)基的相關(guān)成分，使培養(yǎng)基的滲透勢發(fā)生改變，最終導(dǎo)致試管苗枯萎。因此，綜合生根率和生長狀況，本實(shí)驗(yàn)番茄汁較適濃度為100 g∕L。結(jié)合方差分析，NAA的F值＞F0.05（2，8），即P＜0.05，說明NAA濃度變化對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大；而番茄汁和GA3的F值均＜F0.05（2，8），即P＞0.05，表明番茄汁和GA3的濃度變化對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。見表7。

表6 不同因素對無菌苗生根的影響

表7 不同因素對無菌苗生根影響結(jié)果方差分析

綜上，本實(shí)驗(yàn)以白及成熟蒴果為外植體對白及組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1∕2MS培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)墓庹湛墒狗N子萌發(fā)速度快，長勢好。在增殖過程中，NAA對白及的增殖影響最大，其次是KT，最優(yōu)組合為MS+6-BA 1.00 mg∕L+NAA 0.05 mg∕L+KT 1.00 mg∕L，增殖系數(shù)達(dá)到1.83。生根過程中，NAA的濃度對生根率和每株試管苗生根數(shù)影響最大，本實(shí)驗(yàn)中白及生根的最優(yōu)組合為1∕2MS+NAA 1.0 mg∕L+GA30.5 mg∕L+番茄汁100 g∕L。