周新娟，鄧 巍，滕 曼，劉碩然，肖 文，楊曉燕*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；3.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

捕食線蟲真菌是指以營養(yǎng)菌絲特化形成的黏性菌絲、黏性分枝、黏性球、黏性網(wǎng)、非收縮環(huán)、收縮環(huán)及冠囊體等捕食器官來捕捉線蟲的一類真菌，是自然界中線蟲種群自然控制的重要因子〔1〕。由于在生防運(yùn)用上表現(xiàn)出巨大的潛力，這類真菌已受到研究者的廣泛關(guān)注。捕食線蟲真菌作為一種兼性菌，既可營腐生生活，又可主動(dòng)捕捉線蟲來獲取營養(yǎng)。在某些干擾因素的影響下，捕食線蟲真菌獲取營養(yǎng)的方式可能會(huì)發(fā)生改變。

火是大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)中獨(dú)特且重要的環(huán)境因子，也是自然界中普遍存在的干擾因素之一?；馃蓴_會(huì)導(dǎo)致植物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化〔2〕，增加植物群落的物種豐富度和多樣性指數(shù)〔3〕，火燒發(fā)生時(shí)燃燒大量的植物凋落物，改變土壤溫度、濕度等進(jìn)而影響土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)〔4〕，提高植物根系的生物量〔5〕，而植物根系與土壤微生物共生又能增加植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收，從而影響土壤微生物的種類和數(shù)量〔6〕。由于全球變暖及計(jì)劃燒除等原因使得未來火干擾在生態(tài)系統(tǒng)中的作用可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，捕食線蟲真菌作為自然界中線蟲種群數(shù)量的重要平衡因子，必然會(huì)受到這一干擾因素直接或間接的影響，但是目前還未見相關(guān)的研究報(bào)道。故本研究對(duì)蒼山火燒跡地、近火燒地和非火燒地的捕食線蟲真菌資源進(jìn)行了調(diào)查，對(duì)比分析不同樣地中捕食線蟲真菌的種群差異，以初步了解火燒對(duì)該類型真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集采集蒼山北部魚山（25°45′49.80″N，100°07′44.64″E）、中部感通寺（25°39′21.84″N，100°10′57.52″E）和南部江風(fēng)寺（25°34′48.10″N，100°12′7.56″E）火燒跡地、近火燒地以及蒼山中部蘭峰（25°40′21.92″N，100°05′19.77″E）非火燒地土壤樣品共208份。采集方法：采集時(shí)去除表層土壤，取0～20 cm深度的土壤300 g左右，裝入自封袋中，詳細(xì)記錄樣品信息，所有采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后4℃冰箱保存，1周內(nèi)處理完所有樣品。

1.2 培養(yǎng)基采用的培養(yǎng)基主要為玉米瓊脂培養(yǎng)基（CMA）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）〔1〕。

1.3 誘餌線蟲的制備線蟲的制備分離采用貝爾曼漏斗法〔1〕。

1.4 捕食線蟲真菌的分離與鑒定

1.4.1 捕食線蟲真菌的分離 采用誘餌平板法，每份土樣取 2～3 g〔1〕，均勻成點(diǎn)狀撒在直徑為 90 mm CMA平板上，土樣間留有一定的空隙，并保證樣品距培養(yǎng)皿邊緣空1 cm左右，這樣可以使捕食線蟲真菌長(zhǎng)至空白處，便于觀察且在單孢分離時(shí)，可減少污染。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。在上述的CMA平板中各加入5 000條左右的線蟲懸液來誘導(dǎo)捕食線蟲真菌孢子的萌發(fā)，常溫避光培養(yǎng)4～5周。

1.4.2 捕食線蟲真菌的捕器誘導(dǎo) 在體視顯微鏡10～100倍下，利用無菌牙簽以無菌操作技術(shù)轉(zhuǎn)接捕食線蟲真菌單個(gè)分生孢子到留有約1 cm×1 cm觀察室的直徑60 mm CMA平板上，密封后置于26.5℃恒溫箱中培養(yǎng)直至菌絲鋪滿觀察室，然后在觀察室中加入制備好的線蟲懸液200條左右，放置于恒溫箱中培養(yǎng)2～4 d，其間需用體視顯微鏡觀察是否產(chǎn)生捕器及捕器類型，并及時(shí)記錄結(jié)果。

1.4.3 捕食線蟲真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 采用粘片法，在體視顯微鏡下黏取分生孢子以及分生孢子梗進(jìn)行形態(tài)觀察及大小測(cè)定，用透明的膠帶粘取捕食線蟲真菌的分生孢子及分生孢子梗，置于滴有適量呂氏美蘭染液的載玻片上，并蓋上蓋玻片，制成臨時(shí)裝片，顯微鏡鏡檢（40×），確定分生孢子和分生孢子梗的類型，測(cè)量分生孢子的大小及分隔數(shù)，最后結(jié)合捕食器官類型，參照文獻(xiàn)〔1〕進(jìn)行形態(tài)鑒定和分類。

1.4.4 捕食線蟲真菌的分子生物學(xué)鑒定 難以通過形態(tài)學(xué)鑒定的種，結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定和分類。

通過ITS（internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene，核糖體RNA上的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）和TUB（β-tubulin gene，微管蛋白編碼基因）基因序列同源性分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定〔7〕。具體方法如下：①采用改良過的CTAB裂解法提取真菌總DNA。②引物合成：ITS基因（預(yù)擴(kuò)增560 bp），引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。TUB基因（預(yù)擴(kuò)增570 bp），引物序列為Btla：5′-TTC CCC CGT CTC CAC TTC TTC TTC ATG-3′，Btlb：5′-GAC GAG ATC GTT CAT GTT GAA CTC-3′，引物由上海生物工程有限公司合成。③PCR擴(kuò)增及檢測(cè)：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。④測(cè)序及同源性比較：PCR產(chǎn)物直接委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定。所測(cè)得的DNA序列與GenBank中捕食線蟲真菌相應(yīng)的DNA序列進(jìn)行同源性比較，同源性達(dá)到98%以上的菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果確定種屬。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理 物種檢出率：OF=（某個(gè)種出現(xiàn)的土樣數(shù)／總的土樣數(shù)）×100%。

某屬出現(xiàn)頻率=（某屬出現(xiàn)的個(gè)體數(shù)／所有種的個(gè)體數(shù)）×100%。

其中，，N為第 種的數(shù)量，N為所有種的數(shù)ii量，Pi為第i個(gè)種占總物種數(shù)的比例，S為采樣點(diǎn)的物種總數(shù)〔8〕。

2 捕食線蟲真菌檢測(cè)結(jié)果

從208份土樣中共分離出150株捕食線蟲真菌，初步鑒定為3屬18種（其中待定種1種）。火燒跡地、近火燒地及非火燒地中，Dactylellina屬、Drechslerella屬和Arthrobotrys屬真菌的出現(xiàn)頻率依 次為 67.39%、20.65%、11.96%，52.94%、8.82%、38.24%，29.16%、0.00%、70.84%；優(yōu)勢(shì)種分別為Dactylellina ellipspspora（OF=36.59%），Dactylellina ellipspspora（OF=16.36%）和Dactylellina drechsleri（OF=16.36%），Arthrobotrys oligospora（OF=30.00%）；多樣性指數(shù)H′分別為2.05、2.35、1.82。見表1。

表1 各樣地捕食線蟲真菌的多樣性

3 分析與討論

3.1 火燒對(duì)捕食線蟲真菌群落結(jié)構(gòu)的影響目前普遍認(rèn)為捕食線蟲真菌廣布于全球各種類型的生境中，Arthrobotrys屬真菌也因生長(zhǎng)快、所需營養(yǎng)少、腐生能力強(qiáng)的特點(diǎn)被認(rèn)為是不同生境土壤中的優(yōu)勢(shì)種群，之后，不同學(xué)者對(duì)不同生境中捕食線蟲真菌資源的調(diào)查研究也都證實(shí)了以黏性菌網(wǎng)捕捉線蟲的Arthrobotrys屬真菌的優(yōu)勢(shì)地位〔9〕。本研究結(jié)果也顯示產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的Arthrobotrys屬真菌是非火燒地中的優(yōu)勢(shì)種群（70.84%），但在近火燒地中Arthrobotrys屬的檢出率明顯下降，產(chǎn)生黏性球、黏性分枝和非收縮環(huán)等捕食器官的Dactylellina屬以及產(chǎn)生收縮環(huán)的Drechslerella屬真菌的檢出率上升，Dactylellina屬（52.94%）取代Arthrobotrys屬（38.24%）成為近火燒地的優(yōu)勢(shì)屬；火燒跡地中Dactylellina屬真菌出現(xiàn)頻率上升為67.39%，種群優(yōu)勢(shì)明顯，表明火燒影響了土壤中捕食線蟲真菌的群落結(jié)構(gòu)，從非火燒地到近火燒地再到火燒跡地，土壤中的捕食線蟲真菌從以Arthrobotrys屬真菌為優(yōu)勢(shì)的群落向以Dactylellina屬真菌為優(yōu)勢(shì)的群落演替。

Gray和Bailey〔10〕對(duì)林地落葉土壤中捕食線蟲真菌的研究發(fā)現(xiàn)，林地上層落物和腐殖質(zhì)層會(huì)限制產(chǎn)收縮環(huán)、黏性分枝以及黏性球的捕食線蟲真菌種群的活動(dòng)，而產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的真菌不受該限制。因此產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲真菌在未受到火燒影響的土壤中成為優(yōu)勢(shì)種群?；馃绊懥肆值厣蠈勇湮锖透迟|(zhì)的厚度，限制收縮環(huán)、黏性分枝以及黏性球生成的因素被削弱，為火燒跡地中Dactylellina屬和Drechslerella屬真菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。林火在燒去上層落物和腐殖質(zhì)層的同時(shí)，改變了土壤各項(xiàng)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)〔11〕，影響了線蟲等土壤動(dòng)物的數(shù)量和多樣性〔12〕，此時(shí)，火燒跡地中腐生能力和捕食能力不同的捕食線蟲真菌會(huì)受到土壤理化性質(zhì)的影響，被迫發(fā)生演替。近火燒地沒有受到地表火燒的直接影響，但火燒產(chǎn)生的高溫和煙塵可能會(huì)對(duì)近火燒地造成影響，近火燒地中捕食線蟲真菌向著以Dactylellina屬真菌為優(yōu)勢(shì)的群落演替。

3.2 火燒對(duì)捕食線蟲真菌多樣性的影響火燒會(huì)對(duì)森林土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響，微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要類群，火燒對(duì)其多樣性影響很大〔13〕。本研究結(jié)果顯示蒼山近火燒地捕食線蟲真菌多樣性最高，火燒跡地次之，非火燒地最低，表明火燒增加了土壤中捕食線蟲真菌的多樣性。Hart等〔13〕發(fā)現(xiàn)林火發(fā)生后土壤中真菌的多樣性增加，這與本研究結(jié)果相符。林火發(fā)生后，土壤在較小空間內(nèi)會(huì)產(chǎn)生較高的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，這種異質(zhì)性為微生物提供了多個(gè)異質(zhì)的微生境，從而增加了土壤的物種容納量〔14〕，這可能是近火燒地和火燒跡地捕食線蟲真菌多樣性增加的原因之一。此外，非火燒地中腐生能力較強(qiáng)的Arthrobotrys屬真菌占據(jù)較多的生態(tài)位，從而抑制了腐生能力相對(duì)較弱的Dactylellina屬和Drechslerella屬真菌，而火燒對(duì)土壤生境的急劇改變使前者的生長(zhǎng)繁殖受到了影響，種群數(shù)量下降，減少了Dactylellina和Drechslerella屬真菌生長(zhǎng)繁殖的競(jìng)爭(zhēng)壓力，同時(shí)，火燒還快速減少了環(huán)境中的抑制因子〔10〕，使Dactylellina和Drechslerella屬真菌種群數(shù)量增加，多樣性隨之發(fā)生改變。近火燒地多樣性高于另外兩個(gè)樣地的土壤，可能是火燒釋放的熱量、煙塵等間接地影響了近火燒地的生境，從而影響了捕食線蟲真菌的多樣性，具體原因仍有待開展進(jìn)一步的研究。

3.3 捕食線蟲真菌捕食器官類型的進(jìn)化捕食器官的形成和分化被認(rèn)為是捕食線蟲真菌適應(yīng)生存環(huán)境的結(jié)果，但在各捕食器官的進(jìn)化地位上，尚存在較大分歧，甚至同一捕食器官的進(jìn)化地位完全相反〔1，15-18〕。各捕食器官的捕食效率高低常被作為判斷其進(jìn)化地位的依據(jù)之一，產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲真菌，因其是目前已經(jīng)調(diào)查過的絕大多數(shù)生境的優(yōu)勢(shì)種群，黏性菌網(wǎng)通常也被認(rèn)為是捕食效率較高的捕食器官〔15-16，19〕。但林慧彪等〔9〕定量測(cè)定了產(chǎn)生不同捕食器官的捕食線蟲真菌的捕食效率后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的種捕食效率普遍不高，且同種不同株的菌株間捕食效率也存在較大差異，因此認(rèn)為將捕食器官作為判斷捕食線蟲真菌進(jìn)化地位的依據(jù)還有待更系統(tǒng)的研究。本研究結(jié)果顯示，非火燒地中產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)的Arthrobotrys屬真菌具有明顯的種群優(yōu)勢(shì)，而在火燒跡地和近火燒地中這種種群優(yōu)勢(shì)被產(chǎn)生黏性球、黏性分枝和非收縮環(huán)等捕食器官的Dactylellina屬真菌代替。而來自火燒跡地的產(chǎn)生黏性球的捕食線蟲真菌菌株，其捕食率和自發(fā)生成黏性球的數(shù)量都顯著高于來自其他生境的同一種菌〔20〕，顯示在火燒這種急劇變化的生境壓力下，Dactylellina屬真菌表達(dá)捕食器官的基因會(huì)更活躍，使其適應(yīng)火燒環(huán)境的能力增強(qiáng)。相對(duì)Arthrobotrys屬真菌種群數(shù)量的快速減少，火燒跡地和近火燒地產(chǎn)收縮環(huán)的Drechslerella屬真菌檢出率增加，說明Drechslerella屬真菌應(yīng)對(duì)急劇環(huán)境變化的能力也較Arthrobotrys屬真菌強(qiáng)。產(chǎn)不同捕食器官的捕食線蟲真菌的群落演替規(guī)律及不同生境中優(yōu)勢(shì)種群的檢測(cè)結(jié)果〔15-19〕說明對(duì)捕食線蟲真菌這個(gè)類群的真菌來說，不同生境下的種群優(yōu)勢(shì)度與捕食線蟲真菌的進(jìn)化地位高低并無直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，只通過分子系統(tǒng)發(fā)育分析和捕食率高低來探究捕食器官的進(jìn)化地位似乎還不夠全面。探究如火燒等劇烈環(huán)境變化下捕食線蟲真菌捕食器官形成機(jī)制和群落演替規(guī)律可能是理解捕食器官進(jìn)化的思路之一。