孫麗英，吳家媛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

牙源性干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)，因具有易獲取、較強(qiáng)的自我更新能力及突出的多向分化能力而在口腔組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究中呈現(xiàn)出較強(qiáng)的應(yīng)用潛質(zhì)?？谇活M面組織再生工程的干細(xì)胞研究目前主要集中在牙髓干細(xì)胞(Postnatal dental pulp stem cells,DPSCs)，脫落乳牙干細(xì)胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)，根尖牙乳頭干細(xì)胞(Stem cells from the apical cells,SCAP)，牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和牙囊干細(xì)胞(Dental follicle precursor cells,DFPCs) 這五種牙源性干細(xì)胞的研究上[1]。然而大量研究表明隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的干性(Stemness)，即自我更新能力和多向分化潛能會(huì)逐漸降低至徹底喪失[2]，從而影響其在臨床實(shí)際應(yīng)用的有效性。干細(xì)胞的干性包括兩個(gè)方面：自我增殖能力和分化全能性或多能性。干細(xì)胞維持自我更新和多向分化潛能的機(jī)制較為復(fù)雜:轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號(hào)通路、微環(huán)境和自噬等對其均有影響。近年來，學(xué)者們力圖通過研究發(fā)現(xiàn)影響牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞衰老、自我更新和多向分化能力的潛在機(jī)制，為口腔頜面組織再生和臨床疾病治療提供合適的種子細(xì)胞，從而獲得新的治療思路。本文根據(jù)近年來對牙源性干細(xì)胞干性維持的分子機(jī)制研究做一綜述。

1 干性相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子

干性基因是一類多能干性基因，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡，對干細(xì)胞干性維持有積極作用，常見的干性基因有Sox2、Oct-3/4、Nanog、Rex1(Reduced expression 1)及Klf(Krüppel-like factors)[3-4]。他們在胚胎干細(xì)胞和部分成體干細(xì)胞中高表達(dá)，隨著干細(xì)胞的分化而表達(dá)下降，在決定干細(xì)胞多能性、狀態(tài)和發(fā)育中起重要作用[5]。未成熟DPSCs也表達(dá)Oct-4和Nanog，其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和細(xì)胞的分化可持續(xù)到第25代[6]。 Wu等[7]也證實(shí)隨著體外傳代次數(shù)的增加，人SCAP中Stro-1、Nanog、Oct4、Sox2和Rex1的基因表達(dá)不斷下降。

轉(zhuǎn)錄因子在多能性維持中具有重要意義，除了內(nèi)在因素的影響，外在因素促使轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化，也可影響干細(xì)胞干性。當(dāng)增加人牙髓干細(xì)胞(Human postnatal dental pulp stem cells,hDPSCs)中的Stro-1、Nanog、Oct4和Sox2的表達(dá)時(shí)，可減少hDPSCs在體外成骨成牙本質(zhì)分化，維持hDPSCs為未分化狀態(tài)[3]。Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLF)是一種進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄因子，在維持mESCs的自我更新中起關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)敲除Klf2、Klf4和Klf5后恢復(fù)其中任何一個(gè)KLF轉(zhuǎn)錄因子都會(huì)恢復(fù)該細(xì)胞的自我更新能力[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在體外培養(yǎng)時(shí)過表達(dá)Klf2，可顯著影響其生物學(xué)活性，提高其增殖及分化潛力[8]。Klf4表達(dá)與牙本質(zhì)礦化也密切相關(guān)，當(dāng)通過核因子IC(nuclear factor I-C,NFIC)上調(diào)Klf4后，牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein 1,Dmp1)的表達(dá)會(huì)增加，從而促進(jìn)牙本質(zhì)礦化[9]。

骨形成蛋白(phogenetic protein,BMP)是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡的重要介質(zhì)[10]。研究發(fā)現(xiàn)BMP7參與體外培養(yǎng)DPSCs后，細(xì)胞的增殖能力可隨時(shí)間的增加而增加，尤其在誘導(dǎo)7d后DPSCs的增殖能力明顯提高，研究者進(jìn)一步證實(shí)高濃度BMP7(100ng/ml)可以更好的增加體外DPSCs細(xì)胞增殖及細(xì)胞的分化[11]。 同樣，使用BMP4誘導(dǎo)PDLCs時(shí)Sox2、Oct-4和c-Myc的表達(dá)一直到PDLCs的第七代仍持續(xù)表達(dá)，并且Sox2和Oct-4的mRNA表達(dá)在第五代和第七代明顯上調(diào)，說明BMP4促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，在細(xì)胞周期的S期中阻滯PDLCs的分化，維持PDLCs未分化狀態(tài)[12]。

Rho/Rho相關(guān)的含有卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated kinase,ROCK)是細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，可決定干細(xì)胞的自我更新和維持干細(xì)胞特性。Rho激酶抑制劑可以提高各種來源干細(xì)胞的存活率及抑制細(xì)胞凋亡，反式-4-[(1R)-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)環(huán)已烷甲酰胺二鹽酸鹽(Y-267632)是ROCK的抑制劑，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、粘附、遷移，代謝和細(xì)胞凋亡，已研究證實(shí) Y-27632可以通過細(xì)胞外信號(hào)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)PDLSCs增殖，上調(diào)c-Myc、Nanog、 Klf4和Oct4的基因表達(dá)水平，促進(jìn)PDLSCs增殖及遷移能力[13]。

正如Y-267632上調(diào)了c-Myc、Nanog、Klf4和Oct4等干細(xì)胞因子，促進(jìn)PDLSCs分化能力一樣，干細(xì)胞基因的作用并不是孤立的，通過結(jié)合多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，或是直接激活啟動(dòng)子的表達(dá)，干細(xì)胞基因之間會(huì)彼此影響和促進(jìn)，從而影響干細(xì)胞的生物學(xué)功能。如Klf4和Klf5通過結(jié)合Oct4、Sox2和Nanog的啟動(dòng)子區(qū)域而形成內(nèi)部的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而反式調(diào)節(jié)Klf4和Klf5的表達(dá)來維持mESCs多能性的潛力[14]。同樣，在HBMSCs中使用慢病毒系統(tǒng)過表達(dá)Klf2促進(jìn)其分化潛能時(shí)，多能性相關(guān)基因如Oct4、Nanog和Rex1的表達(dá)也同時(shí)上調(diào)。Nanog可激活Rex1啟動(dòng)子并調(diào)控Rex1的表達(dá)，最終導(dǎo)致氧化磷酸化向糖酵解代謝的轉(zhuǎn)化，從而有利于維持人類多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)的多向分化能力[15]。同源框(Homeobox,HOX)基因在牙齒發(fā)育、間充質(zhì)分化和增殖中起重要作用，當(dāng)SCAP中 HOXA5缺失時(shí)，p16 INK4A、p18 INK4C和Cyclin A的表達(dá)會(huì)受到影響，從而抑制SCAP的周期進(jìn)展、成骨分化以及細(xì)胞增殖[16]。

2 信號(hào)通路在干性維持中的作用

信號(hào)通路在牙源性干細(xì)胞干性維持中的作用不可或缺。多條信號(hào)通路在維持干細(xì)胞分化潛能方面發(fā)揮巨大作用。如MEK / ERK信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路和環(huán)磷酸腺苷(c AMP,cyclic adenosine monophosphate) 信號(hào)通路等。

MEK / ERK信號(hào)通路通過細(xì)胞周期蛋白B1和TIMP-1蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)bFGF提高HDPCs增殖能力[17]。Pluripotin、雷帕霉素等小分子可以通過如Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白(RasGAP)、ERK1/2和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,m TOR) 等多種信號(hào)通路可上調(diào)Nanog、Oct4和SOX2的表達(dá)、減少細(xì)胞分化、在DPSCs培養(yǎng)中可較長時(shí)間維持其未分化狀態(tài)[u2][A3]，對干性維持有積極作用[18]。Plaisant等[19]發(fā)現(xiàn)抑制Hh 信號(hào)后人MSC的增殖和克隆形成能力都有所降低。激活NF-kB信號(hào)通路提高IL6、IL8的表達(dá)，可以抑制干細(xì)胞的增殖能力，維持其干性[20]。PI3K信號(hào)通路在干細(xì)胞增殖、分化及干性維持中起重要作用。PI3K相關(guān)激酶(PIKK)包含與PI3K序列相似性的Ser / Thr蛋白激酶家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、代謝、遷移、存活和DNA損傷在內(nèi)的各種應(yīng)激的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[21]。作為第二信使的PI3K，激活A(yù)KT和磷脂酰肌醇依賴性激酶1 (phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)，對于調(diào)控細(xì)胞的大小、生長、增殖、存活和糖代謝均有重要作用。當(dāng)AKT激活后， 磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(TSC2)，從而解除TSCl/2對 Rheb的抑制，由Rheb活化雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)激活下游靶蛋白，將對細(xì)胞生長和代謝進(jìn)行調(diào)控[22]。已研究證明PI3K除了對細(xì)胞的增殖作用外，還能促進(jìn)細(xì)胞的自我更新能力以維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。

cAMP信號(hào)通路是研究得較多的與牙源性干細(xì)胞干性相關(guān)的信號(hào)通路。研究表明抑制SCAP 中cAMP信號(hào)通路，會(huì)上調(diào)礦化基因(ALP、OCN、OSX、RUNX2)mRNA的表達(dá)，而抑制SCAP中的cAMP信號(hào)通路后，則下調(diào)礦化基因的表達(dá)[23]。cAMP信號(hào)通路對BMSCs、SCAP的增值與分化有一定的調(diào)節(jié)作用[24-25]。NFIC能夠協(xié)同 cAMP 信號(hào)通路促進(jìn)SCAP的分化[26]。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和生長因子4(fibroblast growth factor4,FGF-4)在長期培養(yǎng)BMSCs時(shí)， 通過抑制LC3-II的表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞衰老，調(diào)控 BMSCs的增殖和分化的潛能[27]。bFGF還可在誘導(dǎo)BMSCs的同時(shí)迅速激活A(yù)KT，隨后激活ERK活化。Wu等于體外長時(shí)間培養(yǎng)SCAP時(shí)發(fā)現(xiàn)bFGF可維持SCAP的干性及Nanog、Oct4、Sox2和Rex1的表達(dá)[7]，同時(shí)證實(shí)此過程中MAPK通路被激活，推測bFGF維持SCAP干性的機(jī)制與MAPK通路相關(guān)。該研究團(tuán)隊(duì)后又證實(shí)Wnt經(jīng)典信號(hào)通路也參與了bFGF 對SCAP干性的維持[28]。也有學(xué)者證明bFGF誘導(dǎo)SHED時(shí)通過激活SHGFs、 FGFR和Akt信號(hào)通路導(dǎo)致Rex1的表達(dá)增加，維持SHED在傳代中的自我更新能力及多向分化的潛能[29]。

3 其他因素

干細(xì)胞的干性維持受到很多條件的影響，除了以上因素，細(xì)胞生長環(huán)境變化如培養(yǎng)條件、激素紊亂、免疫紊亂、代謝改變和組織工程細(xì)胞支架材料等也會(huì)對干細(xì)胞功能及干性造成影響[30-31]。自噬對干細(xì)胞干性維持也有一定的影響，自噬對去除功能失調(diào)的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚積體以及維持干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)(包括自我更新、細(xì)胞分化和體細(xì)胞重編程)至關(guān)重要[26]。雷帕霉素激活小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)自噬后,其干性相關(guān)基因(Nanog、Oct4和Sox2)表達(dá)升高，有助于促進(jìn)細(xì)胞的自我更新與分化[32]。自噬激活后可延緩細(xì)胞衰老，有效促進(jìn)細(xì)胞增殖并增強(qiáng)集落形成能力。微環(huán)境發(fā)生變化也可能導(dǎo)致相關(guān)組織中相關(guān)干細(xì)胞功能衰退包括自我更新能力降低、錯(cuò)誤分化和呈現(xiàn)衰老相關(guān)的分泌表型[33]。

4 展望

隨著再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，關(guān)于干細(xì)胞的研究越來越受到關(guān)注。在體外保持干細(xì)胞特性一直是口腔再生醫(yī)學(xué)的挑戰(zhàn)，在適度的增殖能力與良好的分化潛能之間尋找理想平衡是牙源性干細(xì)胞發(fā)揮組織修復(fù)作用的關(guān)鍵。通過對牙源性干細(xì)胞干性維持機(jī)制的深入研究，不僅有利于掌握牙源性干細(xì)胞應(yīng)用的調(diào)控手段，還可進(jìn)一步明確牙源性干細(xì)胞干性維持原理，為臨床研究提供足夠的干細(xì)胞，使細(xì)胞在傳代和擴(kuò)增的同時(shí)不降低其自我更新能力及多向分化潛能成為可能。