王 舒，蔡善君

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 眼科，貴州 遵義 563099)

鈣在細胞生理過程中至關重要，且與各種生物學功能有關，包括蛋白質(zhì)分泌、細胞外吞、收縮、基因轉(zhuǎn)錄和細胞生長等。值得注意的是，引起細胞內(nèi)鈣不穩(wěn)定的任何干擾都會促使細胞功能從正常調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎劳鯷1-2]。目前，鈣信號在誘導細胞凋亡和壞死[3]過程中的核心作用已經(jīng)明確。一般來說，膜去極化觸發(fā)胞內(nèi)鈣內(nèi)流，啟動胞泡融合和胞吐過程，以促進同步突觸傳遞[4]。隧道納米管(tunneling nanotubes，TNT)可以提供一種特異且有效的細胞間通信方式[5-10]。鈣信號通過隧道納米管在視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial，RPE)間轉(zhuǎn)移，打破了以往了解的細胞利用縫隙連接和突觸來與相鄰細胞溝通，為細胞間傳遞鈣離子提供了新的傳遞方式，進一步指導臨床實踐。現(xiàn)對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株Arpe-19通過隧道納米管傳遞鈣離子的相關文獻予以綜述。

1 隧道納米管的簡述

細胞間通訊在正常和異常組織環(huán)境中的作用已經(jīng)被廣泛研究了幾十年。通過對內(nèi)源性運載工具，如外體和微囊泡的研究，加深了細胞間傳遞機制的認識[11-15]。間隙連接和可溶性擴散信號，如細胞因子，需要有效和足夠的信息，且需要在相對較短的距離傳遞。然而，對于在生物微環(huán)境中距離較遠的細胞來說，遠程交流是必要的。例如，由于癌細胞通過基質(zhì)成分分散在腫瘤基質(zhì)中，它們之間的長距離可能會顯著減少它們通過趨化因子、細胞因子或外體/微囊泡的通訊。隧道納米管(TNT)是細胞間一個獨特又高效的聯(lián)絡方式，這可以解釋細胞如何通過隧道納米管引發(fā)一系列疾病 ，特別是在癌癥中。而首次的實驗就是對培養(yǎng)的大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞進行了隧道納米管膜突起的描述?，F(xiàn)在用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的Arpe-19細胞常被TNT連接，且TNT不附著于下層。TNT在細胞間呈直線連接，是一種膜狀細胞的延伸，寬度從50～1 000 nm不等，長度從幾百微米到幾百微米[16-17]，且用掃描電鏡證實了TNT的特征。熒光顯微鏡顯示Arpe-19細胞之間的TNT中含有F-肌動蛋白，而不含微管，當人為添加磚紅霉素B誘導F-肌動蛋白的解聚，會導致TNT的消失。重要的是，這些TNT可以作為像路西法黃(Lucifer Yellow)這樣的小分子的擴散通道，而不是右旋糖酐紅(Dextran Red)這樣的大分子的通道。最近的研究表明，不同細胞所形成的TNT的形態(tài)和組成可能不同。例如，連接人類巨噬細胞的兩種不同類型的隧道納米管：分為只有肌動蛋白的薄納米管和含有肌動蛋白和微管的較厚的納米管(直徑大于0.7 m)，TNT的功能是充當細胞間交換的管道，包括線粒體、鈣離子、蛋白質(zhì)、高爾基小泡、病毒、微RNA(MiRNAs)和外顯子[18-19]。因此，TNT作為細胞的“納米公路”，用于連接不相鄰的細胞介導細胞器和其他物質(zhì)的運輸。倒置顯微鏡和共聚焦顯微熒光成像技術的廣泛應用已成為實驗室識別細胞器及其他物質(zhì)通過TNT和直接細胞間轉(zhuǎn)移的主要手段。

大量的證據(jù)表明，TNT介導的通訊和運輸對于生理條件下正常細胞的功能是必不可少的。雖然隧道納米管形成的分子機制尚不完全清楚，但刺激條件下，如炎癥或任何細胞損傷，已被證明能刺激細胞產(chǎn)生TNT。較短的納米管在未感染的細胞中常見，而長的納米管在被感染的細胞中常見。據(jù)報道，感染病毒的細胞[20]納米管的產(chǎn)生頻率明顯增加，發(fā)現(xiàn)至少有兩種不同的TNT形成途徑。這表明病毒感染可以刺激TNT的形成，一種是從給定的細胞中延伸出來，最終與鄰近的細胞接觸，從而導致TNT的形成，如PC 12細胞和T24細胞[21]所見。在另一種途徑中，是從觀察到許多類型的免疫細胞中發(fā)現(xiàn)的[22-25]，細胞首先接觸，然后出現(xiàn)TNT。這兩個過程不一定是相互排斥的，甚至可以同時發(fā)生在TNT形成過程中。在這兩種情況下，都需要粘附分子來促進TNT的形成和(或)穩(wěn)定。

此外，Austefjord等[26]人在不同類型的細胞之間也檢測到TNT的形成，這些連接有效地介導上皮細胞和成纖維細胞之間的病毒轉(zhuǎn)移。這種轉(zhuǎn)移很可能涉及體內(nèi)的病毒傳播，但在自然感染過程中它或許也發(fā)生。通過TNT的轉(zhuǎn)移可能與細胞間通信的其它途徑(其它類型的細胞突起、外體或間隙)結合，優(yōu)選的途徑可能取決于細胞狀況。

2 人視網(wǎng)膜色素上皮細胞經(jīng)隧道納米管的通訊

2.1 視網(wǎng)膜色素上皮 視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)是視網(wǎng)膜的單層，位于神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡膜之間。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)通過將視網(wǎng)膜與脈絡膜毛細血管床分離而形成血-視網(wǎng)膜屏障[27]。它是一個活躍的屏障，在許多方面支持神經(jīng)元視網(wǎng)膜。RPE為視網(wǎng)膜提供營養(yǎng)因子，吞噬從感光器脫落的盤膜，回收維甲酸以維持視覺周期，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜下間隙的組成和體積。這種高度極化的色素上皮在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜下間隙的體積和化學成分方面起著至關重要的作用。它也促進了神經(jīng)視網(wǎng)膜和血管絨毛膜間營養(yǎng)物質(zhì)和離子的雙向轉(zhuǎn)運[28]。RPE作為一種血-視網(wǎng)膜屏障，選擇性地轉(zhuǎn)運生物分子，釋放保護視網(wǎng)膜所必需的各種因素。盡管RPE細胞具有重要的生理功能，但對RPE細胞間的信號轉(zhuǎn)導通路知之甚少。電生理學研究表明，所有的視網(wǎng)膜細胞通過間隙連接[27-28]與相鄰細胞進行通訊。連接蛋白43(Cx43)介導的間隙連接細胞間通訊參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜修復和再生。一些研究報告說[29]，細胞凋亡信號可通過間隙連接傳遞，從而對其相鄰細胞產(chǎn)生不利影響。這表明RPE細胞在生理條件下具有非?；钴S的細胞間通訊。

2.2 視網(wǎng)膜色素上皮細胞間的TNT TNT在不同細胞類型中的直徑、長度、結構和功能各不相同，Arpe-19細胞中的TNT，典型直徑為50～300 nm，長度可達120 mm。在Arpe-19細胞培養(yǎng)中，Wittig D[30]發(fā)現(xiàn)了直接以TNT相互連接兩個細胞，偶爾也發(fā)現(xiàn)多達三個或四個不同的TNT連接的細胞，Arpe-19細胞互相接觸后形成TNT。這些細胞一開始有接觸，然后移動，形成細胞-細胞之間的連接，隨著細胞的分裂而拉長，隨之產(chǎn)生TNT。最近 在線粒體功能失調(diào)的細胞中發(fā)現(xiàn)，線粒體可以在細胞間的TNT內(nèi)移動[31-32]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)干細胞與RPE細胞直接相接觸的情況下通過TNT將線粒體轉(zhuǎn)運至RPE細胞。而年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜退行性疾病與線粒體的功能密切相關[33-36]。所以，研究RPE細胞間的隧道納米管可以為眼底疾病提供新的治療方向。

3 人RPE細胞傳遞鈣信號的產(chǎn)生與傳播

3.1 機械刺激誘導人視網(wǎng)膜色素上皮細胞間Ca2+波的傳播 目前，TNT被證明以類似于細胞間通過間隙連接傳輸鈣波的方式介導細胞間鈣信號的傳遞，且能夠在不親密接觸的細胞之間傳輸。Khamidakh[37-38]為了研究這一過程，通過單個細胞的機械刺激在Arpe-19單層中誘導細胞間Ca2+波。在存在和不存在細胞外Ca2+的情況下，當細胞內(nèi)儲存Ca2+耗盡后使用Ca2+敏感熒光染料fura-2，用單劑量法來檢測單層細胞內(nèi)Ca2+濃度的動態(tài)變化。應用間隙連接阻斷劑α-甘草次酸后，在匯合的單層Arpe-19細胞內(nèi)單個細胞的機械刺激引發(fā)Ca2+增加，其以波狀方式傳播到相鄰細胞。這種局部刺激經(jīng)常在TNT連接的細胞中產(chǎn)生強大的Ca2+信號，從而擴大了通信的范圍。

Arpe-19細胞表現(xiàn)出兩種不同的Ca2+波，其傳播機制依賴于細胞位置：在接近機械刺激部位的細胞中，Ca2+波主要通過間隙連接傳播，并且需要來自細胞內(nèi)Ca2+的儲存和細胞外培養(yǎng)基，而更遠的傳播更依賴于嘌呤能受體，并不需要細胞外的Ca2+。所提出的方法可以用來體外評估人視網(wǎng)膜色素上皮細胞測定藥物誘導細胞間通訊變化的工具。

3.2 間隙連接在TNT鈣信號傳播中的作用 一些實驗室觀察到TNT中存在連接蛋白和間隙連接，但間隙連接在這些過程和這些疾病中的作用仍在積極研究中[39]。這些觀察表明了由TNT介導的長距離連接通訊的可能性。事實上，間隙連接，例如：電突觸，首次在心肌和神經(jīng)中發(fā)現(xiàn)了在相鄰細胞之間的電遷移。間隙連接在TNT連接的細胞間信號分子的傳遞中有關聯(lián)，已發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性連接蛋白通過免疫熒光技術在TNT內(nèi)或附近定位[40-41]。在多種病理類型的疾病中，TNT形成和TNT介導的細胞間通訊顯著增加，包括病毒感染、癌癥、梅毒以及朊蛋白相關疾病[42-47]。在不同環(huán)境下(比如星形細胞間或巨噬細胞間)，連接蛋白43(Cx43)存在于TNT樣結構中，而間隙連接通道的抑制并不能阻止它們的形成，但會干擾TNT連接細胞之間的正常通訊。這些數(shù)據(jù)表明，這兩個通信系統(tǒng)在協(xié)調(diào)通信方面是相互補充的[48]。

目前已經(jīng)有報告描述了遠距離細胞間Ca2+信號的細胞間交換是通過TNT介導的[48-49]，表明在這些結構上存在某種形式的膜/胞質(zhì)連續(xù)性，或在這一過程中存在活躍的間隙連接通道。目前對細胞間Ca2+波傳播過程所涉及的機制尚不完全明了，但認為間隙連接與TNT密切相關。

3.3 IP3沿TNT擴散的信號傳播 機械刺激除了促進ATP的釋放外，還能通過IP3受體(IP3R)通道促進IP3的產(chǎn)生，進而促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子。在TNT中觀察到局部IP3介導的Ca2+信號，提示它們可能促進細胞間Ca2+波的傳播[50]。原則上，通過TNT傳播Ca2+信號可能是由Ca2+的直接轉(zhuǎn)移、IP 3從被激活的細胞擴散到引起反應細胞內(nèi)的Ca2+釋放或者Ca2+傳遞促進IP3誘導應答細胞內(nèi)Ca2+釋放的混合機制[7]所致。為了區(qū)分這些假設，觀察了TNT連接的連接蛋白(Cx43)細胞之間的通訊，以及細胞內(nèi)Ca2+升高的位置和時間，分別使用機械刺激和IP3的局部光釋放作為刺激，一個關鍵的發(fā)現(xiàn)是，反應細胞中的Ca2+升高是在刺激之后，明顯延遲后才開始的，開啟IP3R通道絕對需要IP3以及Ca2+ [51]。提示被刺激細胞內(nèi)IP3其擴散速度快于Ca2+的升高，Ca2+波沿TNT的主動傳遞可能是通過連接的細胞網(wǎng)絡進行通訊，連接細胞在IP3濃度升高后才打開鈣通道，使得Ca2+波迅速升高。

4 展望

隧道納米管(TNT)是細胞間遠程通信系統(tǒng)的一種形式，可以介導細胞間鈣信號的遠距離傳輸，在人RPE細胞中發(fā)現(xiàn)了鈣離子沿隧道納米管傳播，鈣離子產(chǎn)生及傳播的方式通過間隙連接或主動產(chǎn)生IP3，進而產(chǎn)生、傳遞鈣離子。這為治療眼底疾病開辟了新的治療機會，為利用隧道納米管作為細胞輸送管道打開一扇新的大門?；蛟S可以通過藥物調(diào)節(jié)這些過程來阻止或增加它們的形成，以掌控通過TNT傳播的致病和健康成分的傳輸。