王宇佳，米澤云，丁寄葳，岑山

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HIV-1 Rev蛋白在病毒復(fù)制中的功能

王宇佳，米澤云，丁寄葳，岑山

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室

人獲得性免疫缺陷病毒 HIV-1 編碼的 Rev 蛋白由 116 個(gè)氨基酸組成，分子量為 19 kD，主要定位在細(xì)胞核中。Rev 具有三個(gè)不同的功能區(qū)：N 端的第 35 ~ 50 個(gè)氨基酸之間編碼了一個(gè)精氨酸富集區(qū)域（arginine-rich-motif，ARM）作為 Rev 的核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）。Rev 的 NLS 區(qū)域主要負(fù)責(zé)蛋白的核定位功能以及與 Rev 反應(yīng)元件（Rev response element，RRE）的莖環(huán) RNA 序列特異性相互作用，介導(dǎo) Rev 單體間聚合[1]。Rev 的第 10 ~ 24 個(gè)氨基酸是核擴(kuò)散抑制信號(hào)（nuclear diffusion inhibitory signal，NIS），主要維持 Rev 的功能以及 Rev 在細(xì)胞核的亞細(xì)胞定位。第三個(gè)活性區(qū)域位于第 73 ~ 84 個(gè)氨基酸之間，是異亮氨酸富集的區(qū)域，包含一個(gè)核輸出信號(hào)（nuclear export signal，NES）。該區(qū)域直接與細(xì)胞染色體維持蛋白 1（chromosomal region maintenance 1，CRM1）相互作用。研究表明在 HIV-1 的復(fù)制過程中，Rev 執(zhí)行了多種生物學(xué)功能，其中包括病毒 RNA（vRNA）的核輸出、增強(qiáng)病毒蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn) vRNA 基因組的核體化[2]，以及負(fù)調(diào)控 HIV-1 整合[3]。本文主要圍繞 Rev 在病毒復(fù)制早期和晚期的功能展開論述。

1 輔助 vRNA 從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)

在 HIV-1 復(fù)制過程中，早期的病毒 mRNA 轉(zhuǎn)錄本經(jīng)完全剪接，形成各種編碼早期蛋白質(zhì)（Tat、Rev 和 Nef）的 mRNA；然而晚期的轉(zhuǎn)錄本剪接不完全或者未剪接，直接被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿中作為表達(dá) Gag 等病毒蛋白的模板或作為基因組包裝入病毒顆粒。由于病毒不完全剪接或未剪接的轉(zhuǎn)錄本中含有內(nèi)含子，其核輸出需要 HIV-1 Rev 蛋白和 RRE。RRE 為 HIV-1 基因組里的一段 250 bp 的序列，位于結(jié)構(gòu)基因 Env 中。Rev 可以特異性地識(shí)別和結(jié)合 RRE。RRE 通過鏈內(nèi)氫鍵折疊，可以形成由 5 個(gè)莖環(huán)組成的穩(wěn)定 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)域 I 是一個(gè)構(gòu)成不完美的雙螺旋，其主要功能是維持 RRE 功能結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有較低親和力的 Rev 結(jié)合位點(diǎn)[4]；結(jié)構(gòu)域 IIB 中具有一個(gè)富含嘌呤核苷酸的不對(duì)稱凸起，它是 Rev 初始結(jié)合的強(qiáng)親和位點(diǎn)[5-6]；結(jié)構(gòu)域 III ~ V 也可能有助于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，但對(duì) RRE 的活性影響較小。然而，關(guān)于 RRE 的精確二級(jí)結(jié)構(gòu)一直存在爭議。研究表明，RRE 包含 4 個(gè)或 5 個(gè)莖環(huán)的替代結(jié)構(gòu)，這兩種已發(fā)布的結(jié)構(gòu)在 Rev 結(jié)合位點(diǎn)之外的區(qū)域中有所差異[7]。

Rev 蛋白利用其 NLS 和 NES 信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭，通過結(jié)合不完全剪接或未剪接的轉(zhuǎn)錄本中的 RRE，可將 mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中并進(jìn)行翻譯。在這個(gè)過程中一些宿主蛋白起到了輔助性的作用，其中比較重要的兩個(gè)宿主因子是 CRM1 和輸入蛋白 β（importin-β，IMPβ）。另外，染色質(zhì)鏈接鳥苷酸交換因子（regulator of chromosome condensation，RCC1），能夠水解 Ran-GTP，為 Rev 核質(zhì)穿梭提供能量[8]。在細(xì)胞核中，單個(gè) Rev 單體與 RRE 結(jié)構(gòu)莖 IIB 中的高親和力位點(diǎn)結(jié)合并開始裝配，并將額外的 Rev單體通過蛋白質(zhì)-RNA 和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用招募 Rev 單體，共聚化形成四聚體（Rev/RRE/CRM1/Ran-GTP）[9]，隨后四聚體復(fù)合物和核孔相互作用，穿過核孔輸出到細(xì)胞質(zhì)中。在四聚體復(fù)合物通過核孔的過程中需要招募一種細(xì)胞—— GTPase 激活蛋白（RanGAP），促進(jìn) Ran-GTP 釋放能量變成 Ran-GDP，從四聚體中釋放出來[10-11]，四聚體穿越核孔，隨后 RanBP1 的參與導(dǎo)致 CRM1 從四聚體中釋放，CRM1 通過核孔輸入到細(xì)胞核中發(fā)揮作用。此時(shí) Ran-GDP 和細(xì)胞質(zhì)中的 Rev 結(jié)合，防止 Rev 重新和 CRM1 結(jié)合。隨后 Rev 的 NLS 區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)中的 IMPβ 結(jié)合促進(jìn)含有 RRE 的 mRNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。隨后三者復(fù)合物穿過核孔將 Rev 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中發(fā)揮作用。在細(xì)胞核中，Ran-GTP 的鏈接導(dǎo)致 Ran 和 importin 復(fù)合物的解離，游離出單體 Rev，繼續(xù)在細(xì)胞核中結(jié)合含有 RRE 的 mRNA 發(fā)揮其功能[11-12]。

2 增強(qiáng) HIV vRNA 的翻譯

Rev 不僅在含有 RRE 的 RNA 的細(xì)胞核輸出中起到了重要的作用，同時(shí)還能增強(qiáng) mRNA 的翻譯水平[13]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，某些突變的 Rev 并不改變 vRNA 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的比例，但是嚴(yán)重影響蛋白表達(dá)[14]。過表達(dá) Rev 可以提高 Env-RRE mRNA 在細(xì)胞質(zhì)中的水平約兩倍，但 Env-RRE 蛋白表達(dá)水平可提高 50 倍之多[15]。與之類似，在 HeLa 細(xì)胞中，Rev 分別增強(qiáng) Gag 的 RNA 和蛋白水平 4.4 和 845 倍。這些研究結(jié)果提示，Rev 除了可以輔助病毒未剪切的 RNA 輸出到細(xì)胞質(zhì)中，還可以增強(qiáng) vRNA 的表達(dá)[16]。

mRNA 的有效翻譯需要結(jié)合多聚核糖體。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)野生型或者功能缺陷的Rev 對(duì)于多聚核糖體中的完全剪接的病毒 RNA 水平?jīng)]有影響，但非剪接形式的病毒RNA 在突變型 Rev 存在的情況下明顯減少。這些結(jié)果提示 Rev 可能在 RNA 核輸出完成后與含有 RRE 的 RNA 在細(xì)胞質(zhì)中繼續(xù)結(jié)合，并進(jìn)而促進(jìn)其進(jìn)入多聚核糖體。Rev-RNA 結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中不完全剪接或未剪接的 Gag/pol、Vif 和 Vpr mRNA 都和 Rev 具有很強(qiáng)的結(jié)合，但是完全剪接的 Tat 和Rev RNA 并沒有類似的情況；當(dāng) RRE 缺失時(shí)，Rev 和 RNA 的結(jié)合基本上消失[2]，這進(jìn)一步驗(yàn)證了 Rev 通過 RRE 介導(dǎo)結(jié)合 RNA 的設(shè)想。同樣的，只有當(dāng) Rev 存在的情況下，才能在多聚核糖體組分中檢測到 Gag mRNA。盡管不同檢測系統(tǒng)和細(xì)胞類型可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生不同的影響，但多數(shù)證據(jù)都表明 Rev 對(duì)于不完全剪接的 HIV-1 RNA 的翻譯有促進(jìn)作用[2]。

之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多宿主因子參與到 Rev 介導(dǎo)的 vRNA 的核輸出過程中，同樣，對(duì)于 Rev 的翻譯調(diào)控，現(xiàn)在也確定一些候選宿主因子在此過程中起到了一定的促進(jìn)作用。真核細(xì)胞翻譯起始因子 5A（eukaryotic initiation factor，eIF5A）是一個(gè)可以和 Rev 具有相互作用的細(xì)胞蛋白，可以引發(fā)病毒 mRNA 的翻譯[17-18]。多聚腺嘌呤結(jié)合蛋白 1（poly(A)-binding protein1，PABP1）可能與 Rev 協(xié)同增強(qiáng) vRNA 的穩(wěn)定性[19]，參與 polyA 尾招募核糖體，進(jìn)而增強(qiáng)依賴于 Rev 的 HIV-1 RNA 翻譯。除此之外，在 Rev 存在的情況下，RNA 解旋酶（RNA helicase A，RHA）可以和 RRE 結(jié)合，促進(jìn)含有 RRE 的 mRNA 的翻譯。Pura 蛋白可以在細(xì)胞質(zhì)中和 Rev、RRE 共定位，促進(jìn)含有 RRE 的基因表達(dá)[20]。

3 增強(qiáng) HIV 病毒基因組 vRNA 的核體化

除了上述 Rev 的功能之外，Rev 還可以促進(jìn) HIV-1 基因組的包裝。在病毒的組裝過程中，病毒的 vRNA 通過位于 5'UTR 的包裝信號(hào)和前體蛋白 Gag 中的核衣殼（NC）區(qū)域相互作用，將病毒基因組帶入至病毒顆粒中。最初確定的 HIV-1 包裝信號(hào)位點(diǎn)是 5'UTR 中的 stem-loop 3，其缺失導(dǎo)致包裝效率降低約 20 倍[21]。然而，僅僅依靠這個(gè)區(qū)域的存在并不能引發(fā)基因組的包裝，這就提示還有其他的序列或者結(jié)構(gòu)參與該過程[2]。研究發(fā)現(xiàn)在 Rev 缺失的時(shí)候，HIV-1 病毒載體的包裝效率和滴度下降到 3%，然而細(xì)胞質(zhì) RNA 水平僅僅降低到 44%。相反，當(dāng)使用缺乏 5'UTR 和 RRE 的密碼子優(yōu)化 HIV-1 表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，Rev 存在與否并不影響包裝效率和滴度[22]。此外，過表達(dá) Rev 蛋白可以提高 Rev 缺失 HIV-1 未剪接 RNA 的細(xì)胞質(zhì)水平 5 倍左右，然而包裝的 HIV-1 RNA 拷貝數(shù)提高 4500 倍。上述研究結(jié)果表明，Rev 對(duì)于 vRNA 的包裝具有促進(jìn)作用。目前關(guān)于 Rev 促進(jìn) HIV-1 基因組包裝的機(jī)制還未完全闡明，推測 Rev 可能通過 loopA 將 RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到特殊的位點(diǎn)，在該位點(diǎn)可以使病毒基因組 RNA 有效地包裝到子代病毒顆粒中[2]。

Blissenbach 等[23]為了確定 Rev 對(duì)原病毒 RNA 包裝效率的影響，進(jìn)行了定量 RT-PCR 分析。在存在或不存在Rev 質(zhì)粒表達(dá)的情況下，用 HIVRev-/4xMS2、Tat 表達(dá)質(zhì)粒和 Hgpsyn 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，用靶向 gag 的引物進(jìn)行定量 RT-PCR 測量細(xì)胞質(zhì)和病毒顆粒中全長 HIV-1 RNA 的量。轉(zhuǎn)染后，Rev 增加了 HIV-1 未剪接 RNA 的細(xì)胞質(zhì)水平，提取的 RNA 從 8.9 × 107增加到 4.9 × 108拷貝/μg。與此相比，Rev 增強(qiáng) HIV-1 RNA 包裝的拷貝數(shù)約為4500 倍。因此推斷 Rev 可以一定程度增強(qiáng)基因組 HIV-1 RNA 的包裝。

4 干擾 HIV cDNA 整合到宿主細(xì)胞

早期的工作發(fā)現(xiàn)，以較高的 MOI 的 HIV-1 感染易感細(xì)胞時(shí)，雖然可以產(chǎn)生大量的病毒 cDNA，但是只有一個(gè)或者幾個(gè)能夠整合到宿主細(xì)胞的基因組里，提示病毒的整合過程有負(fù)調(diào)控機(jī)制[3]。Levin 等[3]發(fā)現(xiàn)在靶細(xì)胞中病毒 cDNA 的整合頻率是受 Rev 調(diào)控的。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，靶細(xì)胞感染野生型的 HIV 和 Rev 缺陷的 HIV 顆粒，盡管產(chǎn)生拷貝數(shù)相同的病毒 cDNA，但是感染缺失 Rev 的 HIV 病毒顆粒發(fā)生整合的頻率比感染野生型效率高 5 倍。同時(shí)，當(dāng)在細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) Rev 的時(shí)候，這兩種病毒的整合效率都明顯下降，初步證明病毒 cDNA 的整合頻率是受 Rev 調(diào)控的。目前通過體外鏈接實(shí)驗(yàn)，雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)均已證明 Rev 和整合酶（IN）具有相互作用。Rosenbluh 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，IN 和 Rev 在酵母細(xì)胞中可以相互作用并形成穩(wěn)定的 Rev-IN 復(fù)合物，其相互作用可抑制 IN 酶活性從而限制了整合作用[25]，這項(xiàng)工作描述了一種限制 HIV-1 整合的新穎的調(diào)節(jié)機(jī)制。隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了 IN 之外，Rev 也可以和參與病毒整合的宿主蛋白 p75 相互作用，進(jìn)而抑制其輔助整合的功能[26]。原則上講，HIV-1 的輔助蛋白往往對(duì) HIV-1 的復(fù)制起到促進(jìn)作用，然而 Rev 抑制病毒整合對(duì)于 HIV-1 感染是否有利呢？目前已證實(shí) HIV-1 的 Env、Nef 和 Vpu 蛋白能夠下調(diào)細(xì)胞中 CD4 受體，從而阻止超級(jí)感染的發(fā)生。因此，HIV-1 可能利用 Rev 抑制病毒 cDNA 整合，阻止基因毒性和超級(jí)感染的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制[18]。

5 展望

目前臨床使用的抗 HIV 藥物多為蛋白酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和整合酶抑制劑，這些靶向病毒的藥物容易產(chǎn)生耐藥性，因此尋找抑制 HIV 的新方法是一項(xiàng)持續(xù)而重要的工作。綜上所述，Rev 在 HIV-1 的生活周期中執(zhí)行著十分重要的作用，通過對(duì) Rev 生物學(xué)功能及作用機(jī)制的不斷深入研究，Rev 有可能成為新的抗 HIV 藥物治療的靶點(diǎn)。

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岑山，Email：shancen@hotmail.com

2018-12-05

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.013