張晶瑩，魏彥鋒*，梁紅敏，崔玲玲

（山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100）

葡萄是葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（VitisL.）落葉藤本植物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，品種豐富，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。截止到2016年，我國葡萄栽培面積達(dá)84.7萬 hm2，產(chǎn)量1374.5萬 t[1-2]，入圃保存的葡萄種質(zhì)資源超過3000份[3]。葡萄種質(zhì)資源豐富，易芽變，易扦插繁殖，且不同地區(qū)之間品種交流頻繁，造成同名異物或同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，給葡萄的選育和推廣帶來很多不便。葡萄酒作為葡萄最主要的加工產(chǎn)品，其質(zhì)量與原料種植的生態(tài)環(huán)境、品種、采收釀造年份等有著密切的關(guān)系，隨著葡萄酒市場的擴(kuò)大，一些低劣、假冒葡萄酒產(chǎn)品給消費(fèi)者帶來很多困擾和損害。目前，鑒定和評價(jià)葡萄及葡萄酒品質(zhì)的方法主要是通過測定主要化學(xué)成分，或理化指標(biāo)、感官審評等，具有一定的局限性，缺乏客觀的科學(xué)量化依據(jù)。

指紋圖譜技術(shù)，是在現(xiàn)代分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來的從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的一大類技術(shù)的統(tǒng)稱。以圖譜的形式呈現(xiàn)，強(qiáng)調(diào)對植物研究對象“共有特征性”的研究，并在共有特性中尋找個(gè)性差異。目前在中藥或天然藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域應(yīng)用最為成熟，是國際公認(rèn)的最有效手段。指紋圖譜技術(shù)首先將樣品經(jīng)適當(dāng)前處理，再采用一定的分析手段，得到能夠標(biāo)示其某一特征的圖譜，最后將譜學(xué)分析法與計(jì)量學(xué)處理方法相結(jié)合，建立葡萄指紋圖譜能有效解決葡萄品種鑒定、產(chǎn)地識別、種屬相關(guān)等問題，建立葡萄酒指紋圖譜能準(zhǔn)確區(qū)分和鑒別釀造品種、酒齡和產(chǎn)地。筆者就近年來指紋圖譜技術(shù)在葡萄及葡萄酒方面的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

1 指紋圖譜技術(shù)的分類

隨著指紋圖譜的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大及新技術(shù)的產(chǎn)生，其分類也在不斷延伸、細(xì)化。目前，根據(jù)不同的分析手段和特征性成分，可將指紋圖譜分為生物指紋圖譜和化學(xué)指紋圖譜兩大類：生物指紋圖譜包括蛋白質(zhì)指紋圖譜、DNA指紋圖譜等；化學(xué)指紋圖譜包括光譜指紋圖譜、色譜指紋圖譜等。

1.1 生物指紋圖譜

生物指紋圖譜是由多態(tài)性豐富的電泳圖譜組成的，具有高度的特異性和穩(wěn)定性，能夠鑒別生物個(gè)體或群體之間的差異。根據(jù)電泳分離的物質(zhì)不同，可分為蛋白質(zhì)指紋圖譜和DNA指紋圖譜，后者在葡萄種質(zhì)資源研究領(lǐng)域應(yīng)用較多。蛋白質(zhì)指紋圖譜，或叫蛋白電泳指紋圖譜，主要是以聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（SDS-PAGE）來完成的，在國內(nèi)外廣泛用于水稻、玉米、小麥、大麥、豌豆等作物的品種鑒定與分類中，在煙草種子、川白芷種子、貝母等植物相關(guān)研究中也有探索。葡萄蛋白質(zhì)主要集中在葡萄籽中，而葡萄籽約占葡萄重量的5%左右[4]，經(jīng)過脫脂脫酚工序后的葡萄籽粕中的粗蛋白含量僅為11%～13%[5]，蛋白質(zhì)含量低且不易提取純化是蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在葡萄研究領(lǐng)域應(yīng)用較少的原因，所以本文不再討論。

DNA指紋圖譜是目前最具吸引力的生物鑒定技術(shù)。生物體內(nèi)存在一些高變異性的DNA序列，它們能在本類群或個(gè)體中穩(wěn)定遺傳，從而在生物體內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的、可遺傳的差異。DNA指紋圖譜技術(shù)就是利用這些DNA序列，通過不同的分子標(biāo)記技術(shù)來構(gòu)建的。首先利用共同的引物，對多個(gè)對象進(jìn)行檢測，然后尋找出檢測對象中變異性相對較大的特定DNA片段，最后擴(kuò)增，以電泳圖譜的形式展現(xiàn)，即作為該檢測對象的特征性DNA指紋圖譜。常用的分子標(biāo)記技術(shù)有：簡單重復(fù)序列或微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）、內(nèi)部簡單重復(fù)序列（ISSR）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）等[6]。

1.2 化學(xué)指紋圖譜

化學(xué)指紋圖譜是建立在化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用色譜、光譜等現(xiàn)代分析技術(shù)，以圖形、圖像和數(shù)據(jù)的方式對物質(zhì)的特性和有效成分進(jìn)行表征，并加以描述，從而全面反映植物對象所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而達(dá)到識別真?zhèn)?、辨認(rèn)優(yōu)劣和質(zhì)量判定等目的。

光譜技術(shù)主要有紫外光譜、紅外光譜、熒光光譜、核磁共振光譜等，目前廣泛應(yīng)用于中藥、食品、香精香料等行業(yè)的質(zhì)量控制和品質(zhì)鑒定中。光譜技術(shù)應(yīng)用在葡萄酒主要成分的定性分析較多，定量分析也大都只針對某一指標(biāo)如酒精度、pH、糖類、酸類等。李霞[7]用近紅外光譜結(jié)合PLS法，以95個(gè)‘赤霞珠’干紅葡萄酒樣品為研究對象，建立了5個(gè)品質(zhì)指標(biāo)定量模型，創(chuàng)新了組合預(yù)處理方法。但研究發(fā)現(xiàn)，近紅外光譜技術(shù)不適用單體花色苷成分的檢測，而花色苷是紅葡萄酒中最重要的特性成分，所以光譜指紋圖譜不適于在葡萄酒領(lǐng)域應(yīng)用推廣，所以本文不再單獨(dú)討論，有以色譜技術(shù)為主光譜技術(shù)為輔的指紋圖譜方法在下文中出現(xiàn)。

色譜指紋圖譜技術(shù)在葡萄酒研究領(lǐng)域應(yīng)用較多，應(yīng)用的色譜技術(shù)以高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）為主，還有儀器聯(lián)用技術(shù)如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）等。

2 DNA指紋圖譜技術(shù)在葡萄研究上的應(yīng)用

葡萄栽培主要是利用其無性繁殖的特性，易于品種傳播和品質(zhì)保持。但由于葡萄屬種間雜交容易，使得一個(gè)品種可能有來自多個(gè)類群的血統(tǒng)，即會產(chǎn)生一些中間型或過渡型雜交；加上自然雜交、栽培環(huán)境不同以及自身變異等，這些因素都導(dǎo)致了葡萄品種混淆、不易分辨的普遍現(xiàn)象。

傳統(tǒng)的種質(zhì)鑒定方法以形態(tài)學(xué)為主，如對表型性狀“嫩梢梢尖形態(tài)”“幼葉表面顏色”“上表面光澤”等的描述，這種方法易受環(huán)境條件和主觀因素的影響。而且隨著育種工作中骨干親本的集中使用，葡萄品種間的遺傳差異越來越小，因此僅憑對表型性狀的差異描述很難做到準(zhǔn)確鑒定和分類?；贒NA分子標(biāo)記技術(shù)的指紋圖譜方法可以大大提高種質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確度，減少工作量，它具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定、多為共顯性、遍及整個(gè)基因組等優(yōu)點(diǎn)，為保護(hù)葡萄種質(zhì)資源和全面系統(tǒng)命名提供了有效的技術(shù)支持。近幾年，許多學(xué)者嘗試?yán)肦APD、SSR、SRAP、ISSR、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平上對葡萄屬植物進(jìn)行品種間的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和品種鑒定等方面的研究。

2.1 親緣關(guān)系分析

葡萄植株樣本親緣關(guān)系越近，分子標(biāo)記的多態(tài)性差異越小，反之亦然。DNA指紋圖譜技術(shù)就是利用了這一性質(zhì)，有效識別品種的親本和后代，進(jìn)而重新構(gòu)建品種的親緣關(guān)系系譜，為遺傳改良提供依據(jù)。姚玉新等[8]為明確釀酒葡萄品種‘蛇龍珠’的身份，先用RAPD將14個(gè)釀酒品種劃分為4個(gè)類群，再用SSR對‘蛇龍珠’所在類群進(jìn)一步分析，證實(shí)了‘蛇龍珠’是一個(gè)獨(dú)立的品種，和‘品麗珠’‘美樂’‘赤霞珠’有較近的親緣關(guān)系。Laucou等[9]利用20對SSR引物對葡萄砧木品種‘弗卡（Fercal）’進(jìn)行分析，確定其母本為‘B.C. n°1B’、父本為‘31 Richter’，排除了傳統(tǒng)記載中錯(cuò)誤的父本來源‘333 Ecolede Montpellier’，為‘弗卡’的系譜重建提供了理論依據(jù)。史圓圓等[10]采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合聚類分析，對23個(gè)國內(nèi)外主流的無核葡萄品種的種質(zhì)親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示23個(gè)品種被分為4個(gè)類群，其中歐亞品種間親緣關(guān)系較近，歐美雜種具有較高的遺傳多樣性，雜交育種時(shí)應(yīng)注意親本選擇。郭春苗等[11]對新疆44個(gè)相對適宜制干葡萄品種（系）進(jìn)行了基于SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析，按照親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近聚為五大類，并利用4條引物構(gòu)建了品種DNA指紋圖譜，提示同一引物在不同品種間出現(xiàn)相同譜帶的現(xiàn)象不可避免，試驗(yàn)中視情況增加引物組合數(shù)量、結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)完善圖譜是十分必要的。尹玲等[12]收集了國內(nèi)新育成的24個(gè)鮮食葡萄品種，采用6對國際通用的SSR熒光標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行基因分型，證明了SSR標(biāo)記可用于品種鑒定、區(qū)分種屬以及判定倍性，最終建立了外加10個(gè)對照組總共34個(gè)品種的指紋圖譜，可用于品種間親緣關(guān)系的鑒定。

2.2 品種鑒定

通過分子標(biāo)記繪制的指紋圖譜具有個(gè)體特異性，不受環(huán)境、發(fā)育階段的影響，能準(zhǔn)確、快速而省時(shí)地鑒定品種或品系，為作物育種和種質(zhì)管理提供了極大的便利。張永輝等[13]對來源于國家果樹種質(zhì)鄭州葡萄資源圃的16個(gè)中國野生種葡萄及65個(gè)近緣植物的供試材料進(jìn)行分類研究，ISSR聚類結(jié)果顯示‘毛葡萄1099’真實(shí)身份應(yīng)屬于桑葉葡萄，懷疑‘燕山葡萄0947’是一個(gè)種間雜種，混進(jìn)了美洲葡萄的血緣。金炳奎等[14]以東北長白山區(qū)的葡萄品種為材料，對SRAP分子標(biāo)記技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明每個(gè)品種都能找出其特有條帶，6個(gè)山葡萄品種最少可用2對引物來鑒別。Daniela[15]利用RAPD標(biāo)記對來自兩個(gè)種植區(qū)的10個(gè)鮮食葡萄品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)分析樹；鮑露等[16]針對葡萄葉片富含多糖和多酚類等雜質(zhì)影響DNA的提取純化問題，對AFLP流程進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)并建立體系，成功區(qū)分了‘超藤’和‘藤稔’這兩個(gè)親緣關(guān)系十分接近的品種。溫景輝等[17]利用SSR標(biāo)記技術(shù)將20份葡萄材料分為4大類群，進(jìn)一步將山葡萄與歐亞種、美洲雜種很好的分開。楊航宇等[18]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對43份葡萄品種構(gòu)建DNA指紋圖譜，并與VIVC標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可將釀酒品種和鮮食品種、歐亞種和歐美雜種很好的區(qū)分。

2.3 分子身份證及數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)的建立

近幾年，植物“分子身份證”的相關(guān)研究十分火熱，2014年北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心，通過20多年的努力，為18 000多個(gè)玉米品種建立了分子身份證，建成世界最大的玉米DNA指紋庫，囊括了我國全部玉米品種，還有大量國外玉米品種及組合?！胺肿由矸葑C”是在DNA指紋圖譜基礎(chǔ)上提出的概念，即每個(gè)種質(zhì)都擁有一個(gè)屬于自己的字符串形式的代碼，賦予種質(zhì)本身作為識別品種的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。杜晶晶等[19]以保存在國家葡萄品種資源圃內(nèi)的80份葡萄種質(zhì)為試材，利用SSR標(biāo)記技術(shù)，證明了該法可有效用于建立葡萄種質(zhì)資源分子身份證。Emanuelli等[20]利用SSR和SNP標(biāo)記技術(shù)，并結(jié)合基因型和表型信息的對比，對歐洲葡萄種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)評價(jià)，深入分析了歐洲種質(zhì)內(nèi)部的遺傳特性。王慧玲等[21]以北京市農(nóng)林科學(xué)院13個(gè)葡萄新品種為試材，利用SSR標(biāo)記技術(shù)建立指紋圖譜，并賦值編碼構(gòu)建分子身份證，為新品種保護(hù)提供一定的參考。董志剛等[22]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對15份釀酒葡萄進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以及種質(zhì)識別和分類，通過多態(tài)性譜帶有序編碼轉(zhuǎn)換，構(gòu)建其分子身份證系統(tǒng)，也證明了方法的可行性。

由此可以看出，葡萄“分子身份證”的構(gòu)建才剛剛起步，構(gòu)建的過程也促使DNA指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用更加規(guī)范、準(zhǔn)確和深入。比如可利用盡量少且是國際通用的引物來區(qū)分大量的品種、降低數(shù)據(jù)的冗余程度等。在所得到的圖譜后加上涵蓋品種詳細(xì)信息，即將“分子身份證”與形態(tài)學(xué)描述相結(jié)合，就可建立更加完善的葡萄品種分子數(shù)據(jù)庫。李貝貝等[23]對314個(gè)葡萄品種進(jìn)行了DNA指紋數(shù)據(jù)庫的初步構(gòu)建，并將其中61份中國葡萄品種的基因型數(shù)據(jù)，與歐洲葡萄品種分子數(shù)據(jù)庫（www.vivc.de）中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了對比，但該數(shù)據(jù)庫是以Excel表格形式呈現(xiàn)出來的，不利于共享。所以要建立更加完善的葡萄品種數(shù)據(jù)庫，還需對數(shù)據(jù)分析、圖譜識別、系統(tǒng)整合等方向做深入研究。

3 色譜指紋圖譜技術(shù)在葡萄酒研究上的應(yīng)用

一款高品質(zhì)葡萄酒幾乎都會冠上“產(chǎn)地酒”“品種酒”和“年份酒”的標(biāo)簽，彰顯著較高的商業(yè)價(jià)值，但其真實(shí)性很難快速查證。目前，我國現(xiàn)行的葡萄酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對理化指標(biāo)、衛(wèi)生指標(biāo)有嚴(yán)格的要求。在國際上，除了理化及衛(wèi)生指標(biāo)外，也只加重了感官鑒定的比重。所以對于葡萄酒的釀造品種、產(chǎn)地甚至年份的考察幾乎沒有科學(xué)準(zhǔn)確的方法，這也讓不法廠家有了各種形式的造假可能。

應(yīng)用色譜指紋圖譜技術(shù)可以全面且直觀地反映葡萄酒中的化學(xué)成分種類與數(shù)量，利用酒中特征性成分，對葡萄酒的真實(shí)屬性及品質(zhì)進(jìn)行有效評價(jià)。指紋圖譜技術(shù)不需要測定葡萄酒的各種化學(xué)成分，即不需要對單一成分進(jìn)行定量，避免使用昂貴的標(biāo)準(zhǔn)樣品，只需對酒中特征性化學(xué)成分的含量或組成利用色譜分析方法展現(xiàn)出來，從宏觀上分析被測酒樣之間的差異，為葡萄酒質(zhì)量控制提供科學(xué)有效的方法。常用的色譜方法有高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC），還有些儀器聯(lián)用方法如氣相-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）等。

HPLC主要是以葡萄酒中不易揮發(fā)的特征性組分如多酚類物質(zhì)為檢測對象再結(jié)合模式識別方法來建立圖譜。樣品前處理簡單，不需要定性每個(gè)成分，只需要確保一致性，能滿足以指紋圖譜方法來控制葡萄酒質(zhì)量、辨別真?zhèn)蔚闹饕康模訦PLC具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢[24]。GC則適用于具有揮發(fā)性成分的葡萄酒香氣的指紋圖譜研究，它具有樣品用量少、選擇性強(qiáng)、分離速度快且效能高等優(yōu)點(diǎn)。揮發(fā)性成分也是鑒定葡萄酒品種的重要依據(jù)，不同品種釀造的葡萄酒，香氣組分會有顯著差異，甚至存在特有的典型香氣。儀器聯(lián)用方法如GC-MS、HPLC-MS不僅利用了色譜的高分離效能，還兼?zhèn)淞速|(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性和高靈敏性，能夠提供指紋圖譜中主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，還能克服因色譜峰重疊而造成的定性、定量不準(zhǔn)確的問題，已成為化學(xué)指紋圖譜技術(shù)研究的重要手段。

3.1 葡萄酒品種的鑒定

釀造品種是決定葡萄酒質(zhì)量的根本因素，但采用DNA鑒定方法沒有意義，因?yàn)閺钠咸丫浦刑崛NA幾乎是不可能的。葡萄酒釀造品種由于其遺傳特性，在化學(xué)成分上表現(xiàn)出較大的差異，例如不同葡萄品種的多酚物質(zhì)含量構(gòu)成會有一定的差異，所以多酚物質(zhì)的含量和比例能直接反應(yīng)紅葡萄酒品種[25]。國內(nèi)外對葡萄及葡萄酒中的花色苷（花色素）、單體酚等多酚類物質(zhì)進(jìn)行了大量的研究和鑒定，但從整體性上對葡萄酒多酚指紋圖譜的研究、對不同品種葡萄酒進(jìn)行識別的相關(guān)研究才剛剛起步。

Revilla等[26]利用HPLC分析發(fā)現(xiàn)，‘赤霞珠’‘美樂’‘門西亞（Mencía）’‘加爾納?。–arnacha）’葡萄品種的花色苷圖譜存在明顯的不同，‘加爾納恰’葡萄酒的錦葵色素葡萄糖苷相對含量達(dá)到64.69%，顯著高于其他品種葡萄酒，‘赤霞珠’的錦葵色素乙酰葡萄糖苷相對含量達(dá)到30.35%，顯著高于其他品種。張軍翔等[27]利用HPLC建立了9個(gè)不同品種葡萄酒的花色苷指紋圖譜，數(shù)據(jù)顯示出各品種葡萄酒之間花色苷種類和含量存在差別，山葡萄種及雜種葡萄酒的特征色譜峰中，有一些明顯與歐亞種不同，由此可作為判別標(biāo)準(zhǔn)。郭艷波[28]以2～3個(gè)年份的南方野生山葡萄酒為研究對象，葡萄來源分別為福建省溪塔溝產(chǎn)刺葡萄品種和廣西引種的‘桂葡一號’毛葡萄，構(gòu)建了南方野生葡萄酒中單體酚HPLC指紋圖譜，很好的區(qū)分了兩個(gè)品種的山葡萄酒。

3.2 酒齡和產(chǎn)地的區(qū)分

酒齡是紅葡萄酒重要的商業(yè)指標(biāo)之一，消費(fèi)者普遍認(rèn)為酒齡越大其葡萄酒的質(zhì)量越好、價(jià)格越貴。近些年，各式各樣的葡萄酒品鑒培訓(xùn)活動廣受歡迎，雖然感官品嘗可以鑒定葡萄酒酒齡，但需要高超的品鑒技藝和豐富的品酒經(jīng)驗(yàn)，主觀影響因素很大。因此，急需客觀科學(xué)的葡萄酒酒齡鑒定方法，為質(zhì)量監(jiān)督部門和消費(fèi)者提供方法依據(jù)。

較年輕的紅葡萄酒中存在大量的游離花青素，使葡萄酒體呈紫紅色，隨著陳釀時(shí)間的延長，尤其是陳釀1年后，游離花青素迅速減少[29]，聚合形成更加穩(wěn)定的色素形態(tài)如單寧，酒體會由亮紫色轉(zhuǎn)向磚紅色，而老齡葡萄酒苦澀味減輕、磚紅色褪去。所以利用葡萄酒陳釀過程中花青素和聚合色素的變化規(guī)律，采用HPLC指紋圖譜方法，可分析鑒定紅葡萄酒酒齡。張軍翔等[30]研究發(fā)現(xiàn)，6個(gè)不同酒齡的‘蛇龍珠’葡萄酒的HPLC花青素指紋圖譜明顯不同。李彪[31]結(jié)合GC-MS和IR技術(shù)對不同品牌、但同酒精度同香型的白酒進(jìn)行研究，所建指紋圖譜可以區(qū)分不同年份的白酒，該研究中建立的方法和識別用的模型可以為鑒定葡萄酒的酒齡提供參考。

國內(nèi)外葡萄酒長期生產(chǎn)實(shí)踐及研究表明，酒體中的酚類物質(zhì)、香氣物質(zhì)的含量和比例與生產(chǎn)地域密切相關(guān)，也就是說，來自不同地域的同一品種葡萄酒，其特性明顯不同[32]。王秀芹等[33]發(fā)現(xiàn)5個(gè)不同產(chǎn)地的‘赤霞珠’葡萄酒中，酚酸、黃烷-3-醇和黃酮醇這3種酚類物質(zhì)的含量存在明顯差異。韓國民[34]在確定了葡萄酒中14種單體酚的HPLC測定方法的基礎(chǔ)上，分別建立了來自四川九寨溝和云南香格里拉的‘赤霞珠’干紅葡萄酒的HPLC指紋圖譜。謝建軍等[35]研究南非、法國、澳大利亞、智利等10個(gè)常見葡萄酒產(chǎn)地的85份紅葡萄酒樣品GC指紋圖譜，結(jié)果表明不同國家的紅葡萄酒GC指紋圖譜存在差異，其色譜峰的相對峰面積和數(shù)量不同，即各有特征峰，證明該法可以用來甄別假冒產(chǎn)地葡萄酒。張憲臣[36]等通過使用GC-MS建立了進(jìn)口‘霞多麗’干白葡萄酒香氣物質(zhì)特征指紋圖譜，使用HPLC-DAD-MS建立了進(jìn)口‘霞多麗’干白葡萄酒酚類化合物特征指紋圖譜，進(jìn)而建立了利用雙指紋圖譜溯源產(chǎn)地的方法。

3.3 真?zhèn)纹咸丫畦b定

目前國內(nèi)市場上一般存在3種情況的摻假葡萄酒：第一，摻水。目的是降低葡萄酒的生產(chǎn)成本；第二，添加商標(biāo)上未說明的化學(xué)物質(zhì)，如色素。目的是增強(qiáng)葡萄酒顏色，提高外觀品質(zhì)；第三，進(jìn)行商標(biāo)上未說明的勾兌，如使用非歐洲種勾兌歐洲種葡萄酒。目的是降低生產(chǎn)成本，提高感官品質(zhì)。劣質(zhì)葡萄酒輕者是假冒品種、酒齡和產(chǎn)地，夸大產(chǎn)品價(jià)值；重者直接通過各種造假手段進(jìn)行偽造。而現(xiàn)行的葡萄酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只是對酒中常量或微量理化成分、微生物和重金屬含量進(jìn)行了限定，如何利用化學(xué)或物理方法對葡萄酒的品質(zhì)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的評定是當(dāng)前學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

莫寅斌[37]通過試驗(yàn)研究建立了葡萄酒HPLC花色素指紋圖譜及識別模式，對賀蘭山東麓的不同品種紅葡萄酒進(jìn)行了區(qū)分，還對市售葡萄酒進(jìn)行鑒別，成功鑒定出一款摻水和另一款添加了黑米色素的摻假葡萄酒。謝建軍等[38]通過對10個(gè)主要葡萄酒生產(chǎn)國所產(chǎn)的85份紅葡萄酒進(jìn)行GC分析，提取紅葡萄酒12個(gè)典型的共有峰，構(gòu)建了紅葡萄酒GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，能夠?qū)κ袌錾铣Ｒ姷?種所謂“三精一水”勾兌的假葡萄酒成功鑒別。

4 總結(jié)與展望

在葡萄種質(zhì)資源研究領(lǐng)域，應(yīng)用基于DNA分子標(biāo)記技術(shù)的指紋圖譜技術(shù)，可以從DNA水平上對葡萄屬植物進(jìn)行品種間的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和品種鑒定等方面的研究，進(jìn)而建立葡萄分子身份證及數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)。要建立一個(gè)完善的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，需要整合信息資料（品種信息、引物信息等）、數(shù)據(jù)類資料（DNA指紋數(shù)據(jù)、形態(tài)學(xué)性狀數(shù)據(jù)等）和圖片類資料（形態(tài)性狀的圖片、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖等），這也是研究者們繼續(xù)深入的目標(biāo)，為中國葡萄栽培育種及種質(zhì)資源的保護(hù)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

另外，將葡萄DNA指紋圖譜技術(shù)與QTL（數(shù)量性狀基因座）定位相結(jié)合，可為研究葡萄重要性狀的基因定位、克隆產(chǎn)生巨大促進(jìn)作用。劉震東[6]采用SSR和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)分別構(gòu)建了‘紅地球’‘雙優(yōu)’‘北冰紅’的分子遺傳圖譜，對其雜交后代、自交后代的抗寒性進(jìn)行鑒定及QTL定位研究，為抗寒基因的定位、克隆，以及分子標(biāo)記輔助育種創(chuàng)造了可能性，對提高葡萄抗寒育種水平具有重要意義。

在葡萄酒研究領(lǐng)域，應(yīng)用色譜指紋圖譜技術(shù)，根本目的是研究和控制葡萄酒的質(zhì)量。其意義在于：葡萄酒指紋圖譜可以通過保留時(shí)間來定性分析酒中某類化學(xué)成分的數(shù)量與組成，若使用標(biāo)準(zhǔn)品還可以精確定量，為監(jiān)控葡萄酒質(zhì)量提供有力的保障。規(guī)范葡萄栽培實(shí)踐，提高葡萄酒生產(chǎn)廠家對產(chǎn)品質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)。葡萄酒指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的制定，必須建立在對葡萄酒來源的全面了解基礎(chǔ)上，即確保酒品質(zhì)及來源信息的真實(shí)準(zhǔn)確性。

還有幾個(gè)問題值得注意：以花色苷為被檢測對象進(jìn)行分析建立指紋圖譜的方法，僅適用于紅葡萄酒，因?yàn)榧t葡萄酒在皮、汁混合發(fā)酵過程中，將大量花色苷留在了酒體中，而白葡萄酒經(jīng)皮汁分離僅用果汁發(fā)酵，花色苷含量很少，不適用此法。紅葡萄酒中花色苷種類、含量和比例，主要受葡萄品種影響，所以在建立酒齡和產(chǎn)地的指紋圖譜分析中，首先要避免葡萄品種差異的影響。除了葡萄品種，還有一些外在因素對酒中多酚類物質(zhì)有影響，比如陳釀條件不同，特別是較高的溫度會減少游離花青素含量，造成酒齡指紋圖譜的改變，影響鑒定的準(zhǔn)確性，所以葡萄酒HPLC指紋圖譜鑒定酒齡的方法目前僅適用于同一生產(chǎn)廠家的葡萄酒，特別是在商標(biāo)上標(biāo)明年份的紅葡萄酒酒齡的區(qū)別鑒定，即適合葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)用來制定企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，利于品質(zhì)控制。