李旋，亓桂梅*，王超萍

（山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100）

葡萄酒是一種發(fā)酵飲料，其釀造過程既是微生物的作用過程，也是酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物。葡萄酒的釀造最初采用的是自然發(fā)酵技術(shù)，也就是利用附著在果皮及存在于車間、空氣等環(huán)境中的天然酵母完成發(fā)酵過程，由于此過程是由多種酵母的混合作用，因此對(duì)葡萄酒穩(wěn)定性及風(fēng)味的影響往往難以預(yù)測，對(duì)此國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了較為全面的研究[1-2]，逐漸了解天然釀酒酵母的種類、性能，進(jìn)行了大量試驗(yàn)和優(yōu)化[3-4]。近幾十年，隨著科技進(jìn)步及商業(yè)酵母的推出，釀酒師已經(jīng)放棄了傳統(tǒng)的自然發(fā)酵法，利用商用酵母進(jìn)行純種發(fā)酵。商用釀酒酵母具有很多優(yōu)點(diǎn)，能夠耐高酒精度、耐高溫，競爭營養(yǎng)物的能力較強(qiáng)，使葡萄酒的風(fēng)味更有保障[5]，但不能很好地體現(xiàn)葡萄酒的復(fù)雜性和典型性。

葡萄汁中的微生物除釀酒酵母外，還存在一些非釀酒酵母（non-Saccharomycescerevisiae），研究發(fā)現(xiàn)，其代謝產(chǎn)物對(duì)葡萄酒的香氣、風(fēng)味和品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。但由于人們?cè)谄茢∑咸丫浦蟹蛛x出了非釀酒酵母，因此認(rèn)為它們會(huì)給葡萄酒釀造帶來不良影響。實(shí)際上，非釀酒酵母可以產(chǎn)生甘油、高級(jí)醇及其它揮發(fā)性化合物，有利于提升葡萄酒的香氣、風(fēng)味等感官特征，但也可能會(huì)產(chǎn)生不良的氣味和影響[6]。因此，酒商們采用各種方法（例如改善地窖的衛(wèi)生狀況，控制發(fā)酵pH、SO2含量、溫度等）抑制其中的“破壞者”，使“相容者”與釀酒酵母協(xié)調(diào)作用，釀造出風(fēng)味更豐富的優(yōu)質(zhì)葡萄酒。我國對(duì)非釀酒酵母菌的研究仍處于起步階段，與國外相比存在較大差距，因此，了解非釀酒酵母的種類和特點(diǎn)，以及對(duì)葡萄酒發(fā)酵的影響，對(duì)指導(dǎo)葡萄酒生產(chǎn)有重要意義。

1 非釀酒酵母的種類

葡萄酒釀造環(huán)境中，酵母菌廣泛存在于葡萄表面和地窖、設(shè)備表面，葡萄破碎過程中，酵母菌被轉(zhuǎn)移到葡萄汁中[7]。葡萄汁發(fā)酵旺盛時(shí)期，受乙醇含量、氧氣缺乏、低pH等因素的影響，大部分非釀酒酵母會(huì)死亡；此外，釀酒酵母的接種量、營養(yǎng)限制也會(huì)對(duì)非釀酒酵母的生存產(chǎn)生影響[8-9]。

研究人員普遍認(rèn)為，葡萄園中最多的非釀酒酵母是檸檬克勒克酵母（Kloeckera）和有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），占分離菌株的50%～75%[10]。炎熱地區(qū)葡萄園中的非釀酒酵母以有孢漢遜酵母為主，寒冷地區(qū)以檸檬克勒克酵母為主，而中等氣候地區(qū)兩者數(shù)量大致相當(dāng)[11]。非釀酒酵母可以分為3組：（1）好氧型酵母，例如畢赤酵母屬（Pichiaspp.）、德巴利酵母屬（Debaryomycesspp.）、紅酵母屬（Rhodotorulaspp.）、假絲酵母屬（Candidaspp.）、白隱球酵母（Cryptococcus albidus）；（2）低發(fā)酵活性的酵母，例如有孢漢遜酵母、罕見有孢漢遜酵母（Hanseniaspora occidentalis）；（3）高發(fā)酵活性酵母，例如馬克斯克魯維酵母（Kyryveromyces marxianus）、德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、拜氏接合酵母（Zygosac-charomyces bailii）[12-13]。

2 非釀酒酵母的作用

葡萄酒的一類香氣來源于葡萄，二類香氣則來源于酵母發(fā)酵作用形成的各種揮發(fā)性產(chǎn)物及濃度。不同的非釀酒酵母可以產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，包括酯類、高級(jí)醇、甘油、萜類化合物、琥珀酸、乙酸及乙醛等，這些代謝產(chǎn)物是形成葡萄酒感官特性的風(fēng)味物質(zhì)，影響葡萄酒的香氣、口感及酒體[15-17]。

3 非釀酒酵母對(duì)葡萄酒成分的影響

3.1 對(duì)酒精含量的影響

一項(xiàng)葡萄酒消費(fèi)者調(diào)查顯示，年輕消費(fèi)者更偏愛酒精度低的葡萄酒，因此，人們對(duì)低醇葡萄酒的研究更加關(guān)注[18]。有研究表明，利用一些非釀酒酵母的氧化代謝可以降低葡萄酒的酒精含量[19-20]，如在有氧條件下，使用土星擬威爾酵母（Williopsis saturnus）和亞膜漢遜酵母（Pichia subpelliculosa）對(duì)葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵后，可獲得3%(v/v)乙醇含量的葡萄酒，其品質(zhì)也被廣大消費(fèi)者接受[21]。

3.2 對(duì)葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

早期研究人員認(rèn)為非釀酒酵母不適合葡萄酒發(fā)酵，但隨著深入研究，人們發(fā)現(xiàn)一些種屬如假絲酵母、克勒克酵母或有孢漢遜酵母，可以通過代謝和自溶來提高葡萄酒的香氣，參與復(fù)雜風(fēng)味物質(zhì)的形成。國外對(duì)不同非釀酒酵母產(chǎn)生的風(fēng)味化合物的研究比較多，已經(jīng)被證實(shí)具有增加葡萄酒香氣的作用。

3.2.1 酯類

人們已經(jīng)從葡萄酒中鑒定出超過160種酯類，這些酯類可以對(duì)葡萄酒質(zhì)量產(chǎn)生積極影響。通常情況下，非釀酒酵母可以比釀酒酵母產(chǎn)生更多的酯類，這也是自然發(fā)酵的葡萄酒比接種發(fā)酵的葡萄酒成分更復(fù)雜的原因，研究發(fā)現(xiàn)，有孢漢遜酵母和畢赤酵母具有很好的產(chǎn)乙酸酯（白葡萄酒的主要揮發(fā)性香味物質(zhì)）的能力，此外，產(chǎn)酯高的非釀酒酵母還包括異常畢赤酵母、異常漢遜酵母和檸檬克勒克酵母。有研究表明，發(fā)酵過程中克勒克酵母數(shù)量較少是導(dǎo)致西班牙巴斯克（Basque）地區(qū)白福爾葡萄酒缺乏復(fù)雜香氣的原因之一[22]。

3.2.2 高級(jí)醇

不同非釀酒酵母會(huì)產(chǎn)生不同含量的高級(jí)醇（正丙醇、異丁醇、異戊醇、旋性戊醇）[23]。通常高級(jí)醇在餐后葡萄酒中的含量并不希望過高，但如果濃度過低也會(huì)帶來不醇厚和單調(diào)的味感，有研究表明，非釀酒酵母比釀酒酵母產(chǎn)生高級(jí)醇的量更少，但不同菌株之間存在很大差異[24]。

3.2.3 甘油

經(jīng)過多年的打拼，我現(xiàn)在求學(xué)工作于北大，兩位老人是欣慰的，也許他們最放心的就是我這個(gè)把苦吃得快成“厭食癥”的兒子。

甘油是酵母在葡萄酒發(fā)酵中的代謝產(chǎn)物，有助于提高葡萄酒的順滑感、甜度和復(fù)雜性。星形假絲酵母（Candida stellatta）和檸檬形克勒克酵母可產(chǎn)大量的甘油，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位，賦予葡萄酒柔和性、甜度和黏稠度，目前一些國家鼓勵(lì)生產(chǎn)甘油含量高的葡萄酒，但是，甘油對(duì)不同類型葡萄酒的影響程度不同[25]。

3.2.4 萜烯醇

萜烯及萜烯醇類對(duì)葡萄品種特有香氣的形成至關(guān)重要，如麝香葡萄的香氣便是萜烯帶來的。研究發(fā)現(xiàn)，使用德爾布有孢圓酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵‘長相思’葡萄汁，所獲得的葡萄酒與使用釀酒酵母單一發(fā)酵的葡萄酒相比，萜烯醇的濃度更高?？梢?，一些非釀酒酵母對(duì)葡萄酒中萜烯醇類濃度的增加具有顯著效果[26]。

3.2.5 其他風(fēng)味物質(zhì)

葡萄酒中已知的風(fēng)味物質(zhì)超過680種[27]，這些風(fēng)味化合物以糖基化的前體物質(zhì)存在，可以被β-葡萄糖苷酶水解形成游離揮發(fā)物，改善酒的風(fēng)味，但釀酒酵母基因組無法編碼產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶[28]，而一些非釀酒酵母菌則可以產(chǎn)生，并在非揮發(fā)性前體物質(zhì)釋放成揮發(fā)性化合物方面發(fā)揮著重要作用，例如德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬和克勒克酵母屬等[29]。

3.3 對(duì)葡萄酒酸度的影響

葡萄酒的酸度源于葡萄中酒石酸和蘋果酸，以及發(fā)酵產(chǎn)生的琥珀酸、乳酸和乙酸。為了降低葡萄酒的乙酸含量，研究人員使用德爾布有孢圓酵母和釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，結(jié)果表明，以德爾布有孢圓酵母與釀酒酵母＝20∶1的比例接種進(jìn)行混合發(fā)酵，所釀制的葡萄酒揮發(fā)性酸和乙醛分別減少53%和60%[30]。一些非釀酒酵母還可以產(chǎn)生琥珀酸[31]，琥珀酸可以通過提高葡萄酒的總酸度來提升葡萄酒的特性。一般非釀酒酵母比釀酒酵母產(chǎn)生的琥珀酸更多，但各菌屬產(chǎn)量各不相同，在產(chǎn)琥珀酸的酵母中，最主要的酵母是星形假絲酵母。值得注意的是，琥珀酸具有“鹽苦味”，過量會(huì)對(duì)葡萄酒質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。

研究發(fā)現(xiàn)，使用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）可以減少葡萄酒中蘋果酸的含量[32-33]。研究人員使用粟酒裂殖酵母和釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，改善了酵母菌之間的競爭，并減少了由粟酒裂殖酵母引起的消極感官特征；粟酒裂殖酵母的突變體還達(dá)到了葡萄酒降酸的效果[34]。此外，使用固定化的粟酒裂殖酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵控制生物脫酸的效果更好，在這個(gè)過程中，釀酒酵母幾乎可以使用所有可用的糖進(jìn)行發(fā)酵，固定化的粟酒酵母細(xì)胞則使用蘋果酸，消除了粟酒裂殖酵母對(duì)葡萄酒品質(zhì)的不良影響[35]。

3.4 對(duì)葡萄酒顏色的影響

葡萄酒的顏色也會(huì)受非酵母菌酵母的影響，但國內(nèi)外的相關(guān)研究并不多。有研究表明，使用季也蒙畢赤酵母（P. guillier-mondii）和釀酒酵母混合發(fā)酵，可以增加提高顏色穩(wěn)定性的酚醛吡喃花青素分子的形成[36]，其他非釀酒酵母對(duì)葡萄酒顏色的作用還有待確定。

3.5 對(duì)細(xì)菌的影響

除了影響葡萄酒的酒精含量、風(fēng)味和顏色外，非釀酒酵母也會(huì)影響葡萄酒細(xì)菌的生長和活性。蘋果酸-乳酸發(fā)酵是葡萄酒生產(chǎn)難以控制的二次發(fā)酵過程，通常在糖分轉(zhuǎn)化為酒精之后正式開始[37]，但自發(fā)進(jìn)行的蘋果酸-乳酸發(fā)酵的結(jié)果往往難以預(yù)測，甚至引起葡萄酒的腐敗[38]。混合發(fā)酵中，非釀酒酵母在發(fā)酵初期消耗必需的營養(yǎng)物質(zhì)，抑制二次發(fā)酵所需乳酸菌的生長，發(fā)酵后期形成的其他副產(chǎn)物促進(jìn)乳酸菌的生長，因此，可以利用非釀酒酵母控制葡萄酒二次發(fā)酵的開始時(shí)間，較少葡萄酒的腐敗現(xiàn)象。

4 混合發(fā)酵中酵母菌的相互作用

非釀酒酵母在葡萄酒生產(chǎn)中完全發(fā)酵的能力不夠，產(chǎn)酒精的能力也稍差，但如果完全抑制非釀酒酵母則會(huì)降低葡萄酒香氣的復(fù)雜性[39]。近年來，在葡萄酒釀造過程中同時(shí)添加釀酒酵母和非釀酒酵母已經(jīng)成為改善葡萄酒品質(zhì)的有效方法[40-41]?；旌习l(fā)酵中的各種酵母菌并不是被動(dòng)共存的，而是相互作用并產(chǎn)生不可預(yù)料的化合物，從而影響葡萄酒的化學(xué)組成。例如，在檸檬形克勒克酵母的絮狀菌株與釀酒酵母的非絮狀菌株的混合發(fā)酵中，酵母菌之間的相互作用可以誘導(dǎo)產(chǎn)生共絮凝[42-43]。絮凝性是微生物的一個(gè)重要特性，發(fā)酵臨近結(jié)束時(shí)，大量微生物細(xì)胞絮凝在一起結(jié)塊沉下，發(fā)酵液因而得到澄清。絮凝性能良好的微生物，發(fā)酵結(jié)束時(shí)能迅速沉淀，不僅降低分離細(xì)胞所耗的能源，而且可以避免細(xì)胞長時(shí)間懸浮于發(fā)酵液中造成自溶的危險(xiǎn)[44]。

此外，研究人員使用耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和釀酒酵母混合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了生物降酸[45]；使用釀酒酵母和法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniaspora valbyensis)混合發(fā)酵控制接種時(shí)間，有效增加了乙酯類物質(zhì)含量，降低了乙醇含量[46]。

總之，非釀酒酵母具有釀酒酵母所不具有的特殊釀酒特性，并且可以對(duì)葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)生疊加效應(yīng)。混合發(fā)酵可以通過酵母菌之間的代謝相互作用，改善葡萄酒的組成和香氣。

5 發(fā)展趨勢

酵母菌是葡萄酒生產(chǎn)中的主要微生物，通過一系列代謝機(jī)制和活動(dòng)影響葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的形成[47]，酵母菌種的選擇是提高葡萄酒感官質(zhì)量的重要途徑。我國對(duì)于非釀酒酵母影響葡萄酒香氣機(jī)理的研究尚處于起步階段，分離篩選具有我國產(chǎn)區(qū)特色的非釀酒酵母是今后葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢[48]。

目前，研究人員已經(jīng)對(duì)天然酵母和商業(yè)酵母的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并探索了基因表達(dá)方法和基因組分析，還在mRNA和蛋白質(zhì)水平上研究了酵母細(xì)胞對(duì)葡萄酒發(fā)酵條件的適應(yīng)性，但非釀酒酵母的相關(guān)研究并不多，需要深入研究非釀酒酵母的遺傳和代謝調(diào)控方面的問題。此外，混合發(fā)酵的管理比單一發(fā)酵的管理更復(fù)雜，我們對(duì)釀酒酵母與非釀酒酵母之間代謝相互作用的了解還非常有限，因此，發(fā)酵期間不同菌種之間相互作用及接種方式的影響還需進(jìn)一步加強(qiáng)。