蔡立鵬, 呂曉飛, 張 蓓, 李小英, 趙曉甫

(河北省環(huán)保產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院, 國家環(huán)保產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心, 河北 石家莊 050091)

果蔬清洗劑屬于A類洗滌劑[1],可以直接接觸食品?，F(xiàn)在市面上的果蔬清洗劑很多宣稱具有抗菌、抑菌等作用[2],防腐劑和抗氧化劑作為低成本的抗菌劑和抑菌劑常被用來添加到果蔬清洗劑中?！妒称酚孟礈靹┰?成分)名單(第一批)》中規(guī)定:列入《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)的食品添加劑可以作為食品用洗滌劑的輔助成分原料。但規(guī)定中沒有明確使用限量,目前也沒有果蔬清洗劑中防腐劑和抗氧化劑的檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此,研究并建立該檢測方法十分必要。

目前關(guān)于防腐劑和抗氧化劑檢測方法的研究,文獻(xiàn)報道大多是關(guān)于化妝品、食品及食品相關(guān)產(chǎn)品的。一般采用樣品溶液直接進(jìn)樣[3,4]、稀釋進(jìn)樣[5]或固相萃取柱凈化后進(jìn)樣[6],然后采用GC[7-10]、GC-MS[11,12]、HPLC[13-16]和HPLC-MS/MS[17-20]等進(jìn)行檢測。但果蔬清洗劑一般采用復(fù)配高效表面活性劑[21,22],基質(zhì)復(fù)雜,前處理提取、凈化難度大;采用HPLC或GC檢測,干擾峰較多,易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象也易造成色譜系統(tǒng)的污染;采用HPLC-MS/MS檢測,表面活性劑成分會嚴(yán)重干擾電噴霧電離(ESI)源的離子化效率[23],因此這些方法不適于果蔬清洗劑中目標(biāo)化合物的提取、凈化和檢測。

本研究采用溶劑替換法除去果蔬清洗劑中的水分,再使用有機溶劑提取,大大降低了乳化效應(yīng);使用GC-MS檢測,通過保留時間和定性離子定性,進(jìn)一步提高了方法的靈敏度與定性的準(zhǔn)確度。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B-7000C,美國Agilent公司),配電子轟擊(EI)源;超聲波清洗器(KQ 5200B,中國昆山超聲儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV 10數(shù)控型)、快速混勻器(GENIUS 3)(德國IKA公司);電子分析天平(MS105DU,感量0.01 mg/0.1 mg,瑞士Mettler Toledo公司)。

防腐劑和抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品分別購自北京百靈威公司、上海安普公司和山東西亞化工公司。防腐劑包括:對羥基苯甲酸甲酯(MP)、對羥基苯甲酸乙酯(EP)、對羥基苯甲酸丙酯(PP)、對羥基苯甲酸丁酯(BP)、對羥基苯甲酸異丁酯(IBP)、甲基異噻唑啉酮(MIT)、苯甲醇(BA)和苯氧乙醇(PE);抗氧化劑包括叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)。無水乙醇、甲醇、乙腈和正己烷均為色譜純試劑;水為屈臣氏蒸餾水;氯化鈉(NaCl)為分析純試劑。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:稱取各防腐劑和抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品約0.05 g(精確至0.000 01 g),用甲醇定容至50 mL,配制成1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃避光保存;再用甲醇逐級稀釋成0.1、0.5、1、2、5和10 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 樣品前處理

除水:稱取果蔬清洗劑樣品約1 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL圓底燒瓶中,加入10 mL無水乙醇,用快速混勻器充分渦旋溶解,于50 ℃、真空度1×104Pa的條件下以45 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干(蒸發(fā)瓶與水接觸深度約為1 cm,如有殘留水分,再加入5 mL無水乙醇進(jìn)行溶劑替換,直至蒸干為止,蒸干后立即停止加熱和抽真空)。

提取:在蒸發(fā)殘渣中加入20 mL正己烷飽和的乙腈溶液,充分振蕩溶解,超聲提取20 min,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,以8 000 r/min離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中,待凈化。

凈化:在上清液中加入5 mL飽和NaCl溶液,充分振蕩,以8 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液至另一50 mL離心管中,再加入5 mL飽和氯化鈉溶液凈化一次,將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中,于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,準(zhǔn)確加入2 mL乙腈,充分溶解殘渣,取1 mL過0.22 μm有機系濾膜,進(jìn)行GC-MS分析。

1.3 分析條件

色譜柱:HP-5MS UI柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:氦氣;進(jìn)樣口溫度:260 ℃。程序升溫:初始溫度80 ℃,保持5 min;然后以20 ℃/min的速率升至150 ℃,保持5 min;再以10 ℃/min的速率升至210 ℃,保持1 min。后運行溫度：300 ℃；后運行時間：5 min；柱流量:1 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣模式:脈沖不分流；脈沖壓力：2×105Pa;不分流時間:0.5 min。

離子源:EI源;離子源溫度:280 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;離子電壓:70 eV;掃描方式:選擇離子監(jiān)測(SIM)模式;溶劑延遲:5 min。12種防腐劑和抗氧化劑的保留時間、定量離子和定性離子見表1。

表 1 12種防腐劑和抗氧化劑的保留時間、定量離子和定性離子Table 1 Retention times, quantitative ions and qualitative ions of the 12 preservatives and antioxidants

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

果蔬清洗劑中含有大量的表面活性劑,有水存在時,幾乎加入任何有機試劑都不會出現(xiàn)分層,有機溶劑提取難度較大。采用水或有機試劑稀釋后直接檢測會對色譜進(jìn)樣系統(tǒng)和色譜柱造成嚴(yán)重的污染并且會降低靈敏度。實驗采用溶劑替換法,利用減壓蒸餾除去樣品中的水分后,再加入有機試劑,使表面活性劑大量析出,從而降低干擾和污染。

實驗比較了乙腈和乙醇作為除水劑時的除水效果。結(jié)果表明,乙腈除水后,表面活性劑吸附在蒸發(fā)瓶內(nèi)壁,很難進(jìn)行下一步有機溶劑的充分提取,而乙醇除水后則無此現(xiàn)象,故選擇乙醇作為替換溶劑,經(jīng)減壓蒸餾除水后,再用有機溶劑提取。

2.2 提取溶劑及其用量的選擇

防腐劑易溶于水、乙醇、甲醇、乙腈和乙醚,抗氧化劑易溶于甲醇、乙醇、乙醚、乙腈和苯類溶劑。乙醚和苯類溶劑毒性較大,故不采用。實驗比較了甲醇、乙醇和乙腈3種溶劑的提取效果,甲醇和乙醇會溶解更多的表面活性劑,選擇性不如乙腈,并且在凈化時不容易分層,乙腈則分層清晰。在乙腈中加入正己烷至飽和后,提取效率更高。因此本實驗采用飽和的乙腈溶液作為提取溶劑。

提取溶劑用量小,難以將被測物質(zhì)全部提取出來,凈化時還會有較多損失;提取溶劑用量大,雖然會提高提取效率,但會溶解更多的表面活性劑,對測定造成干擾。實驗比較了提取溶劑為5、10、15、20、25和30 mL時目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率(見圖1a)。可以看出,提取效率隨提取溶劑用量的增加而提高,但用量達(dá)到20 mL后,變化趨勢明顯降低，故提取溶劑用量選擇20 mL。

圖 1 (a)提取溶劑和(b)凈化溶劑用量對目標(biāo) 化合物提取效率的影響Fig. 1 Influences of dosages of (a) extraction solvent and (b) purification solvent on the extraction efficiencies of the target compounds

2.3 凈化溶液及其用量的選擇

除去水分后仍有一部分表面活性劑會溶解在有機溶劑中,需要進(jìn)一步凈化。實驗比較了水、飽和NaCl溶液和正己烷的凈化效果。加入水后分層效果較差,而加入飽和NaCl溶液和正己烷后樣品分層明顯,但用正己烷洗滌后,抗氧化劑的提取效率明顯下降,飽和NaCl溶液洗滌兩次后能有效降低雜峰的強度和個數(shù),并且保持提取效率在78%以上。故采用飽和NaCl溶液作為凈化溶液。

實驗考察了不同凈化溶液的用量對目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率的影響(見圖1b)。在保證凈化效果的同時,發(fā)現(xiàn)凈化溶劑的用量超過5 mL時目標(biāo)化合物的回收率明顯降低，故凈化溶液量選擇5 mL。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1線性關(guān)系和定量限

按1.1節(jié)方法配制防腐劑和抗氧化劑的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)條件進(jìn)行測定,以各組分定量離子的峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X, mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)。結(jié)果表明,12種防腐劑和抗氧化劑在0.1～10 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999。

根據(jù)3倍和10倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限和定量限, 12種防腐劑和抗氧化劑的檢出限和定量限分別為0.010～0.030 mg/kg和0.030～0.090 mg/kg。

12種防腐劑和抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/L)在選擇離子監(jiān)測模式下的總離子流色譜圖見圖2。

表 2 12種防腐劑和抗氧化劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the 12 preservatives and antioxidants

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

表 3 12種防腐劑和抗氧化劑的加標(biāo)回收率和精密度(n=7)Table 3 Spiked recoveries and precisions of the 12 preservatives and antioxidants (n=7)

圖 2 12種防腐劑和抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/L) 的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of the 12 preservatives and antioxidants in mixed standard solution

2.4.2回收率和精密度

對陰性樣品進(jìn)行 3個不同水平(0.2、2.0和10 mg/kg)的加標(biāo)回收試驗，每個水平進(jìn)行7次平行測定,計算方法的平均回收率和精密度,結(jié)果見表3。12種目標(biāo)化合物的平均回收率為68.3%～115.3%, RSD為3.1%～11.3%。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好,能滿足果蔬清洗劑中12種防腐劑和抗氧化劑的檢測要求。

2.5 實際樣品檢測

按1.2節(jié)及1.3節(jié)的描述對河北省內(nèi)抽取的11批次果蔬清洗劑樣品進(jìn)行檢測,其中2批次檢出BA(16.7 mg/kg和10.3mg/kg); 1批次檢出MIT(18.5 mg/kg); 1批次檢出TBHQ(10.2 mg/kg)。說明果蔬清洗劑中存在添加防腐劑和抗氧化劑的情況。

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

3 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜同時檢測果蔬清洗劑中12種防腐劑和抗氧化劑的分析方法。該方法操作簡單,經(jīng)濟安全,適用于果蔬清洗劑中防腐劑和抗氧化劑的檢測。