楊秀娟, 楊志軍, 李 碩, 鄧 毅*, 楊延澤, 曼 瓊, 李鵬杰

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000;2. 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730000)

血瘀證是中醫(yī)臨床常見的證型,血瘀理論始載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》[1]。目前,依據(jù)血瘀病因病機(jī)可建立如寒凝、氣虛、外傷、郁怒等血瘀證動(dòng)物模型,急性血瘀是其中之一。七情中“憂怒”和六淫中的“寒邪”為急性血瘀主要病因,在情緒暴怒時(shí)機(jī)體會(huì)分泌大量的腎上腺素。可給予大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素(Adr)模擬暴怒時(shí)的機(jī)體狀態(tài),并施以冰水浴刺激模擬“寒邪”刺激,二者合用可綜合建立大鼠急性血瘀模型[2]。

代謝組學(xué)可從整體角度對(duì)機(jī)體生理及病理?xiàng)l件下產(chǎn)生的變化做出代謝應(yīng)答,從內(nèi)源性代謝物層面反應(yīng)生物學(xué)事件,研究生命活動(dòng)規(guī)律,已成為疾病診斷、病理生理等研究的重要手段。超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)法具有高通量、高分離能力、高靈敏度和專屬性等優(yōu)勢(shì),可使基質(zhì)干擾減少,改善極端復(fù)雜樣品的分離狀況[3,4]。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)測(cè)定血瘀模型大鼠血漿代謝組學(xué)數(shù)據(jù),采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選與血瘀證相關(guān)的生物標(biāo)志物,分析代謝通路變化規(guī)律,研究血瘀證形成的代謝機(jī)制,為臨床診斷血瘀證及開發(fā)相應(yīng)的藥物提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司); Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司); ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國(guó)Waters分司)。SA-6000全自動(dòng)血流變檢測(cè)儀(北京賽科希德科技有限公司); Sysmex CA-1500全自動(dòng)血凝儀(鄭州瑞郎光學(xué)光源醫(yī)療電子有限公司);微量采血管40 μL(淄博來(lái)緒醫(yī)用器材有限公司); 5430R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司); AL104電子分析天平(德國(guó)Mettler-Toledo公司)。

無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)遠(yuǎn)交群大鼠(Sprague Dawley, SD)16只,雌雄各半,體重為180～220 g,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(甘)2015-0002。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 血瘀證大鼠模型的建立及分組

按照文獻(xiàn)[2,5,6]的方法復(fù)制血瘀大鼠模型。SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和血瘀模型組,每組8只?？瞻讓?duì)照組不給予刺激,血瘀模型組于第7天皮下注射鹽酸腎上腺素注射液(0.8 mg/kg)共2次,間隔時(shí)間為4 h。第1次皮下給予鹽酸腎上腺素2 h后,將大鼠置于0 ℃冰水中游泳4 min,取出,擦干體表,2 h后再次皮下注射鹽酸腎上腺素注射液0.8 mg/kg,禁食過(guò)夜,造成大鼠急性血瘀模型。

1.3 樣品采集與血液流變學(xué)檢測(cè)

造模后第9天腹主動(dòng)脈取血,記錄大鼠體重及體征變化。腹主動(dòng)脈采血5 mL,加入已添加肝素鈉的離心管中,記為樣本1,用于測(cè)定血液流變學(xué)等指標(biāo)。腹主動(dòng)脈采血2 mL,收集在含有肝素鈉的離心管中,以3 000 r/min的速度于室溫離心10 min,取上清分裝至1.5 mL離心管中,每管0.2 mL,置于-80 ℃冰箱凍存,用于測(cè)定血漿中代謝物,記為樣本2。

采用全自動(dòng)血流變檢測(cè)儀測(cè)定全血黏度(WBV)(1、5、50、100和200/s切變率)、血漿黏度(PV)。

1.4 凝血功能相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

腹主動(dòng)脈取血2 mL,加入已添加檸檬酸二鈉的抗凝管中,采用全自動(dòng)血凝儀測(cè)定活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、纖維蛋白原(FIB)。

1.5 樣品制備

取1.3節(jié)樣本2,在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后,取各組樣本100 μL分別加入400 μL預(yù)冷甲醇/乙腈溶液(1∶1, v/v),渦旋混合,-20 ℃靜置10 min,以12 000 r/min的速度于4 ℃離心20 min,取上清真空干燥。質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈水溶液(乙腈:水=1∶1, v/v)復(fù)溶,渦旋,以12 000 r/min的速度于 4 ℃離心15 min,取上清液進(jìn)樣分析。

人人都說(shuō)內(nèi)蒙古的羊肉好吃。為什么好吃？其實(shí)也沒(méi)什么奧秘，無(wú)非內(nèi)蒙古的羊是吃沙蔥的羊，沙蔥本身去膻氣，羊肉固然就少有膻味。

分別取按1.3節(jié)樣本2方法處理的空白對(duì)照組和血瘀模型組樣本各30 μL,混合,即得質(zhì)控(quality control, QC)樣本,用于測(cè)定進(jìn)樣前儀器狀態(tài)及平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng),并評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.6 UPLC-Q-TOF/MS分析條件

樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UPLC)進(jìn)行分析。使用HILIC色譜柱進(jìn)行分離;柱溫為25 ℃;流速為0.3 mL/min;進(jìn)樣量為2 μL。流動(dòng)相組成:A為含0.2%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸銨的0.05%氨水,B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?0～1.0 min, 95%B; 1.0～14.0 min, 95%B～65%B; 14.0～16.0 min, 65%B～40%B; 16.0～18.0 min, 40%B; 18.0～18.1 min, 40%B～95%B; 18.1～23.0 min, 95%B。整個(gè)分析過(guò)程中樣品置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)而造成的影響,采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊(duì)列中插入QC樣品,用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。樣品經(jīng)UPLC分離后用Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。HILIC色譜分離后的ESI源條件如下:噴霧氣(Gas1): 0.41 MPa;輔助加熱氣(Gas2): 0.41 MPa;氣簾氣(CUR): 0.21 MPa;離子源溫度:600 ℃;離子肼電壓漂移(ISVF):±5 500 V(正負(fù)兩種模式);飛行時(shí)間質(zhì)譜掃描質(zhì)荷比范圍:60～1 000;產(chǎn)物掃描質(zhì)核比范圍:25～1 000;飛行時(shí)間質(zhì)譜掃描積累時(shí)間:0.20 s/spectrum;產(chǎn)物離子掃描積累時(shí)間:0.05 s/spectrum。二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)相關(guān)采集(IDA)獲得,采用高靈敏度模式,IDA設(shè)置如下:排除同位素4 Da;每個(gè)周期監(jiān)測(cè)候選離子:6;去簇電壓(DP):±60 V(正負(fù)兩種模式);碰撞能量:(35±15) eV。

1.7 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成.mzML格式,然后采用XCMS程序進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25×10-6)和二級(jí)譜圖匹配的方式,檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)XCMS提取得到的數(shù)據(jù),刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰。采用SIMCA-P14.1進(jìn)行模式識(shí)別,數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后,進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析,包括無(wú)監(jiān)督主成分分析(PCA),有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。單維統(tǒng)計(jì)分析包括變異倍數(shù)(FC)分析、T檢驗(yàn)及火山圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 模型驗(yàn)證

2.1.1證候變化

與空白對(duì)照組比較,造模后血瘀大鼠出現(xiàn)了弓背、聳毛、毛色無(wú)光澤等證候表現(xiàn),蜷縮少動(dòng),喜扎堆,畏寒喜暖,四肢發(fā)冷,寒戰(zhàn),反應(yīng)遲鈍,爪尾部紫暗,耳緣及鼻唇發(fā)白,飲水、進(jìn)食量減少,大便濕爛,肛門污穢。根據(jù)中醫(yī)理論,造模大鼠出現(xiàn)上述證候,符合中醫(yī)血瘀的辨證范疇。

2.1.2血液流變學(xué)變化

如表1所示,與空白對(duì)照組相比,血瘀模型組大鼠中WBV 1、5、50、100和200/s切變率顯著升高,PV顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.3凝血功能變化

如表2所示,血瘀模型組大鼠PT、APTT值分別為(8.22±0.28) s和(35.17±1.40) s,與空白對(duì)照組相比,數(shù)值顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01); FIB值為(4.54±0.39) g/L,數(shù)值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表 1 血瘀大鼠全血及血漿黏度分析結(jié)果(n=8)Table 1 Results of the whole blood viscosity (WBV) and plasma viscosity (PV) analysis of the blood-stasis rats (n=8)

*P<0.05, **P<0.01, compared with the control group.

表 2 血瘀大鼠凝血指標(biāo)(n=8)Table 2 Coagulation index in the blood-stasis rats (n=8)

PT: prothrombin time; FIB: fibrinogen; APTT: activated partial thromboplastin time. **P<0.01, compared with the control group.

綜上所述,顯示造模成功。

2.2 質(zhì)量控制

將QC樣本的總離子流圖進(jìn)行譜圖重疊(n=6),結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊,說(shuō)明在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中儀器誤差引起的變異較小,采用XCMS軟件對(duì)代謝物的離子峰進(jìn)行提取,將空白對(duì)照組、血瘀模型組和QC樣本提取得到的峰采用Pareto-scaling進(jìn)行PCA分析,正、負(fù)離子模式下QC樣本緊密聚集在一起,表明本試驗(yàn)的重復(fù)性好,結(jié)果見圖2。

綜上所述,本次試驗(yàn)的儀器分析系統(tǒng)穩(wěn)定性較好,試驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠,在試驗(yàn)中獲得的代謝譜差異能反映樣本自身間的生物學(xué)差異。

圖 1 質(zhì)控血漿樣品總離子流圖(n=6)Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of quality control (QC) plasma samples (n=6)

圖 2 電噴霧電離模式下血漿樣本的PCA得分圖Fig. 2 Principal component analysis (PCA) score plots of the plasma samples in the electrospray ionization mode

圖 3 空白對(duì)照組與血瘀模型組大鼠血漿代謝物的(a)PCA、 (b)PLS-DA和(c)OPLS-DA圖Fig. 3 (a) PCA, (b) differentiation analysis of super- vised partial least squares method (PLS-DA) and (c) orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of the rat plasma metabolites in the blank control group and blood stasis model group

2.3 多變量統(tǒng)計(jì)分析

血漿樣品經(jīng)HILIC色譜分離條件得到數(shù)據(jù),經(jīng)處理后得到PCA圖(見圖3a),結(jié)果顯示,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)維度上,空白對(duì)照組與血瘀模型組有一定的分離趨勢(shì)。參考文獻(xiàn)[7],采用PLS-DA和OPLS-DA建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型,來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)。PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法,運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型,來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè),建立空白對(duì)照組與血瘀模型組的PLS-DA模型,經(jīng)7次循環(huán)交互驗(yàn)證得到的模型評(píng)價(jià)參數(shù)R2Y、Q2(R2Y表示模型對(duì)Y變量的解釋率,Q2表示模型預(yù)測(cè)能力)分別為0.995、0.854(正離子模式)和0.996、0.911(負(fù)離子模式),R2Y和Q2均不小于0.5,表明模型穩(wěn)定可靠(見圖3b)。OPLS-DAD在PLS-DA的基礎(chǔ)上進(jìn)行修正,濾除與分類信息無(wú)關(guān)的噪音,提高了模型的解析能力和有效性,建立空白對(duì)照組與模型組的OPLS-DA的模型,從圖3可知,空白對(duì)照組與血瘀模型組分離趨勢(shì)較好。經(jīng)7次循環(huán)交互驗(yàn)證得到的模型評(píng)價(jià)參數(shù)(R2Y、Q2)分別為0.967、0.816(正離子模式)和0.978、0.879(負(fù)離子模式),R2Y和Q2均不小于0.5,表明模型穩(wěn)定可靠(見圖3c)。

2.4 單變量統(tǒng)計(jì)分析

采用FC分析、T檢驗(yàn)及火山圖對(duì)空白對(duì)照組與血瘀模型組的數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量分析,可篩選出血瘀模型大鼠的差異代謝物,以FC>2.0且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn),FC指血瘀模型組相對(duì)于空白對(duì)照組的變化倍數(shù)?；鹕綀D中偏離軸線的點(diǎn)為FC>2.0且P<0.05的差異代謝物(見圖4)。將所得到的差異代謝物進(jìn)行聚類分析,得到熱圖(見圖5)。當(dāng)篩選的代謝物合理準(zhǔn)確,同組樣本可通過(guò)聚類出現(xiàn)在同一簇(cluster)中,聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相似的表達(dá)模式,本試驗(yàn)結(jié)果表明,空白對(duì)照組與血瘀模型組可明顯聚為兩類,表明所篩選的代謝物合理。

圖 4 空白對(duì)照組與血瘀模型組大鼠血漿代謝物火山圖Fig. 4 Volcano map of the rat plasma metabolites in the blank control group and blood stasis model group

圖 5 空白對(duì)照組與血瘀模型組大鼠血漿代謝物熱圖Fig. 5 Heat map of the rat plasma metabolites in the blank control group and blood stasis model group

2.5 差異代謝物篩選及鑒別

與空白對(duì)照組比較,血瘀模型組共篩選出差異代謝物46個(gè),以FC來(lái)評(píng)價(jià)血瘀模型組與空白對(duì)照組間代謝物變化的顯著性,FC>1,代表代謝物相對(duì)含量升高,用“↑”表示;FC<1,代表代謝物相對(duì)含量降低,用“↓”表示。與空白對(duì)照組比較,血瘀模型組中乙酰膽堿、N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸、胞嘧啶、乙酰肉堿、3-甲基組氨酸、甜菜堿、酪胺、異亮氨酸、胸腺嘧啶、二甲基甘氨酸、膽酸、甲基煙酰胺、肉堿、肌氨酸、蛋氨酸、3-甲氧基-4羥基苯基乙二醇-硫酸鹽、苯基丙氨酸、葡萄糖、3-羥苯基丙酸、脫氧胞苷、胸苷、葡萄糖、乳酸顯著上調(diào),吲哚丙酸、磷脂酰膽堿(PC)(14∶0)、PC(18∶1(9Z))、PC(18∶0)、PC(16∶0)、PC(18∶1(9Z)/18∶1(9Z))、甘露醇、甘油、色氨酸等代謝物顯著下調(diào),見表3。

將篩選所得差異代謝物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(www.kegg.jp/kegg/mapper.html)。與空白對(duì)照組比較,血瘀模型組中亞油酸、亞麻酸、LysoPC(16∶0)、LysoPC(14∶0)、LysoPC(18∶0)、LysoPC(18∶1(9Z))、PC(18∶1(9Z)/18∶1(9Z))、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油3-磷脂酰膽堿(SOPC)、花生四烯酸等代謝物水平顯著降低,乙酰膽堿水平升高。這些代謝產(chǎn)物主要參與亞油酸代謝、亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝及花生四烯酸代謝,表明脂質(zhì)代謝物和膽堿類物質(zhì)可能在血瘀疾病中被干擾,這與相關(guān)報(bào)道[8-10]一致。

脂質(zhì)及甘油磷脂代謝:通過(guò)給予大鼠鹽酸腎上腺素和冰水浴后,血瘀模型中磷脂酰膽堿代謝速度加快,磷脂酰膽堿在磷脂酶A2的作用下轉(zhuǎn)化為花生四烯酸,花生四烯酸可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為血栓烷A2、血栓烷B2,造成血瘀及更嚴(yán)重的血栓等一系列心血管疾病[11]。LysoPC也是通過(guò)磷脂酶A2的作用由磷脂酰膽堿產(chǎn)生的,而磷脂酶A2可調(diào)控血管張力并誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙[12]。在血瘀形成中,LysoPC可抑制轉(zhuǎn)錄活動(dòng)組織因子和NF-κB,通過(guò)調(diào)控組織因子的表達(dá)參與血栓形成[13]。

氨基酸代謝:苯丙氨酸是一種人體必需的芳香族氨基酸,機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和正常生理機(jī)能的維持需要穩(wěn)定的苯丙氨酸代謝狀態(tài)。苯丙氨酸在血漿中水平升高可阻斷苯丙氨酸代謝,從而導(dǎo)致血瘀。酪胺、苯酚參與酪氨酸代謝,在血瘀狀態(tài)下,由于酪氨酸羥化酶和多巴胺-β-羥化酶2種合成限速酶的表達(dá)可使得兒茶酚胺和酪胺生成增加[14],在本試驗(yàn)中,酪胺水平升高,酪胺參與酪氨酸代謝,酪氨酸是神經(jīng)遞質(zhì)和激素的前體,包括腎上腺素、去甲腎上腺素等,在體內(nèi)具有增強(qiáng)新陳代謝的作用。腎上腺素和去甲腎上腺素結(jié)合引起血管收縮,增加血液黏度[9]形成血瘀。色氨酸是蛋白質(zhì)生物合成的基礎(chǔ),是神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺合成的前體,5-羥色胺是體內(nèi)重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì),具有很強(qiáng)的收縮血管作用[15],由于體內(nèi)血瘀的形成,造成主要參與色氨酸代謝的L-色氨酸含量在血瘀模型中降低。異亮氨酸屬于支鏈氨基酸,其合成所需的碳骨架來(lái)源于糖無(wú)氧代謝和有氧代謝的中間產(chǎn)物[16],牛磺酸與亞?；撬岽x通路側(cè)面反映了機(jī)體能量代謝水平,血瘀模型中牛磺酸、?；悄懰猁}含量下降,表明血瘀模型大鼠體內(nèi)能量代謝紊亂[17]。

半乳糖代謝和糖酵解:葡萄糖、甘油、甘露糖、乳酸參與了半乳糖代謝和糖酵解,說(shuō)明在血瘀證的病理變化中,心肌需要更多的能量,此時(shí)主要通過(guò)糖酵解來(lái)供應(yīng)[18]。

綜上,血瘀模型主要與脂質(zhì)代謝(LysoPC(14∶0)、LysoPC(18∶1(9Z))、LysoPC(18∶0)、LysoPC(16∶0))、不飽和脂肪酸生物合成(花生四烯酸、亞油酸、亞麻酸)、糖酵解(葡萄糖、DL-乳酸)、半乳糖代謝(D-甘露糖、葡萄糖、甘油、乳酸)、亞油酸代謝(SOPC、亞油酸、花生四烯酸)、甘油磷脂代謝(SOPC、乙酰膽堿)、牛磺酸與亞?；撬岽x(?；撬帷⑴；悄懰猁})、氨基酸代謝(色氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸)、酪氨酸代謝(酪胺、苯酚)等代謝通路有關(guān)。

表 3 電噴霧電離模式下空白對(duì)照組與血瘀模型組中的差異代謝物Table 3 Different metabolites of the plasma sample in the blank control group and blood stasis model group in the electrospray ionization mode

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

VIP: variable importance for the projection; RT: retention time; ↑: up-regulated; ↓: down-regulated.

3 結(jié)論

本文利用代謝組學(xué)的分析手段檢測(cè)血瘀模型大鼠中代謝物的變化,與空白對(duì)照組相比,血瘀模型在脂質(zhì)代謝、糖酵解、氨基酸代謝及不飽和脂肪酸代謝方面發(fā)生不同程度的紊亂,與現(xiàn)有文獻(xiàn)[7,8]報(bào)道情況基本相符。通過(guò)對(duì)相關(guān)代謝物及代謝通路進(jìn)行深入分析,發(fā)現(xiàn)“生物標(biāo)志物群/譜”能全面反應(yīng)機(jī)體代謝功能的變化,也能更好地對(duì)疾病證候進(jìn)行判別歸類分析,并為研究與血瘀證相關(guān)疾病的(冠心病、腦血栓等)機(jī)制、篩查或臨床藥物治療提供一種新的思路。