李 茜，代軍飛，王 俊，丁耀忠，馬 炳，劉永生，張永光，張 杰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730046)

1 病毒樣顆粒簡(jiǎn)介

病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由一種或多種病毒蛋白組裝形成的無(wú)病毒核酸的空心顆粒。VLPs具有與病毒粒子相似的外部結(jié)構(gòu)和抗原性，能攜帶外源蛋白，是構(gòu)建多價(jià)疫苗的理想載體[1]。1978年，Brady和Consigli發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的主要衣殼蛋白能自我組裝成VLPs[2]。1984年，《Nature》雜志刊登了乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)VLPs疫苗的試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)接種人血清源的同源或異源亞型adr和ayw病毒時(shí)，疫苗接種的黑猩猩完全受到保護(hù)[3]。1986年，HBs Ag-VLP疫苗被批準(zhǔn)用于預(yù)防人HBV感染[4]。GSK公司生產(chǎn)的Engerix和Merck公司生產(chǎn)的Recombivax HB成為了世界上第一批VLPs疫苗[5]。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)了多種病毒的衣殼蛋白都能夠自我組裝成VLPs[6]。

VLPs是制備病毒疫苗較為理想的重組蛋白抗原，它具備以下優(yōu)點(diǎn):(1)不含病毒核酸；(2)與病毒顆粒相近的免疫原性；(3)可經(jīng)MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子提呈，激動(dòng)CD4+輔助T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；(4)能激活B細(xì)胞產(chǎn)生高滴度的抗體；(5)本身具有佐劑功能；(6)具有良好的生物相容性，可以作為載體呈現(xiàn)其他抗原[6]。

2 口蹄疫病毒的概述

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，可引起豬、牛、羊及其他偶蹄類動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的自然疫源性疾病口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)[7]?？谔阋呖梢栽斐删薮蟮纳鐣?huì)影響和經(jīng)濟(jì)損失[8]，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health,OIE)法定向其報(bào)告的動(dòng)物傳染病之一。

FMDV有7個(gè)血清型，每個(gè)血清型都易發(fā)生抗原變異，不能形成交叉免疫保護(hù)[9]。FMDV核酸為單股正鏈RNA[10]，其基因總長(zhǎng)為8300個(gè)核苷酸，僅編碼一條多肽鏈，其在蛋白酶的作用下裂解產(chǎn)生4種不同的結(jié)構(gòu)蛋白(VP4、VP3、VP2和VP1)和一些非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[11]。其中，結(jié)構(gòu)蛋白VP1的G-H環(huán)(G-H loop)含有口蹄疫病毒最重要的抗原位點(diǎn)和識(shí)別整合素受體的RGD基序，其周圍是高度可變區(qū)，可以作為外源抗原表位的插入或者替換位點(diǎn)。目前，防治口蹄疫主要是預(yù)防接種疫苗，但是傳統(tǒng)的滅活苗或弱毒苗有散毒和突變的危險(xiǎn)，疫苗的免疫效果還與運(yùn)輸、保存條件等相關(guān)。所以研制安全、低成本、易保存的新型FMD疫苗迫在眉睫。

3 FMDV抗原表位的預(yù)測(cè)

反向遺傳學(xué)的興起為研制新型FMDV疫苗提供了理論支持，它利用現(xiàn)代生物技術(shù)和分子病原學(xué)，通過(guò)分析病毒的基因組序列來(lái)預(yù)測(cè)其所有抗原信息，篩選出合適的抗原用于制備疫苗。這種方法與傳統(tǒng)制備疫苗的方法完全不同，將其稱為反向疫苗學(xué)[12]。

云濤等[12]利用計(jì)算機(jī)技術(shù)和分子生物學(xué)軟件對(duì)口蹄疫病毒OLZ02株采用Garnier-Robson法[13]、Chou-Fasman法[14]預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)蛋白α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲；用Karplus-Schulz法[15]預(yù)測(cè)了結(jié)構(gòu)蛋白的柔軟區(qū)域；用Kyte-Doolittle法[16]分析了其各結(jié)構(gòu)蛋白的親水性；用Emini法[17]預(yù)測(cè)了各結(jié)構(gòu)蛋白的表面可能性；用Jameson-Wolf法[18]預(yù)測(cè)了各蛋白的抗原指數(shù)。眾所周知，α螺旋、β折疊用于維持蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不適合作為抗原表位。柔軟區(qū)域、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲比較疏松，容易與抗體結(jié)合。因此，綜合評(píng)價(jià)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位，表明VP1蛋白含有的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位最多，是研制口蹄疫新型疫苗的首選免疫原。

4 FMDV衣殼蛋白的體外組裝

雖然FMDV衣殼蛋白組裝的具體過(guò)程目前仍不清楚，但體外組裝試驗(yàn)證實(shí)被感染的細(xì)胞中形成了幾種不同的中間體[7]。首先，VP0、VP1和VP3形成5 S原粒，5個(gè)原粒隨后組成12 S五聚體，12個(gè)五聚體構(gòu)成70 S的病毒衣殼，在RNA包入衣殼的過(guò)程中，VP0裂解成VP4和VP2。

Abrams等將P1-2A-3C基因序列置于噬菌體的T7啟動(dòng)子后構(gòu)建重組體，在牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)FMDV衣殼蛋白后，感染BSC 40細(xì)胞[19]。蔗糖密度梯度離心結(jié)果表明：樣品的沉淀物中有70 S VLPs，電鏡下觀察到直徑為30 nm的VLPs。使用單克隆抗體檢測(cè)特定抗原表位表明形成的VLPs具有天然病毒粒子的活性。Mohana等構(gòu)建了含有O型FMDVP1-2A-3C基因的重組桿狀病毒，結(jié)構(gòu)蛋白P1-2A和蛋白酶3C在昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9中得到共表達(dá)，成功組裝成VLPs[20]。Bhat等將O型FMDV的P1-2A基因和突變的3C基因嵌入到載體構(gòu)建重組表達(dá)載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后得到的重組桿粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，細(xì)胞毒傳代后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)到VP0、VP1和VP3蛋白，雙抗夾心ELISA驗(yàn)證表達(dá)的抗原具有很好的抗原性，表達(dá)的蛋白并最終組裝成直徑約25 nm的VLPs[21]。Veerapen等構(gòu)建重組體使FMDVP1-2A基因在本塞姆氏煙草中短暫表達(dá)，并沒(méi)有3C蛋白酶，P1-2A多蛋白被有效地加工成其組分結(jié)構(gòu)蛋白，隨后組裝成VLPs，每克鮮葉材料的VLPs產(chǎn)量為0.030 μg；使用部分純化的VLPs在小鼠中測(cè)試免疫原性，結(jié)果顯示有FMDV特異性抗體產(chǎn)生[22]。Michael等利用FMDV 3C(L127P)突變體，可顯著增加重組FMDV衣殼蛋白的產(chǎn)量，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生了FMDV VLPs，用單劑量該VLPs作為疫苗可以保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牛在同源FMDV的攻擊下免于感染[23]。Guo等利用SUMO表達(dá)系統(tǒng)將Asia I型FMDV的VP1、VP3和VP0與SUMO融合后在大腸桿菌中表達(dá)，切除SUMO基團(tuán)后，3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組裝成VLPs。使用此VLPs免疫豚鼠、豬和牛，能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并檢測(cè)到T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子IFN-γ的分泌。另外，用同源FMDV攻擊該VLPs免疫的動(dòng)物，牛的50%保護(hù)劑量(PD50)高達(dá)6.34[24]。Xiao等在大腸桿菌中開(kāi)發(fā)了一種共表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)單個(gè)質(zhì)粒串聯(lián)驅(qū)動(dòng)FMDV衣殼蛋白(VP0、VP1和VP3)的表達(dá)，共表達(dá)的FMDV衣殼蛋白(VP0、VP1和VP3)通過(guò)10 L規(guī)模的發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)，并且色譜純化的衣殼蛋白在體外自動(dòng)組裝為VLP。用該VLPs接種的牛顯示出高保護(hù)效力，PD50達(dá)到每劑11.75[25]。

5 嵌合FMDV抗原表位的VLPs研究進(jìn)展

5.1 FMDV-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

Dong等將FLAG標(biāo)簽插入FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的GH-Loop可變區(qū)不影響VLPs的形成，說(shuō)明外源肽段的插入不影響FMDV衣殼蛋白的空間結(jié)構(gòu)，但插入肽段的大小會(huì)影響VLPs的組裝效率[26]。將亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗原表位插入O型口蹄疫病毒可變區(qū)，結(jié)果外源表位的插入沒(méi)有影響型O型口蹄疫VLPs的空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)制備的嵌合VLPs能夠被O型口蹄疫和亞洲Ⅰ型特定表位的抗體識(shí)別，說(shuō)明可變區(qū)抗原表位的插入沒(méi)有破壞型口蹄疫病毒可變區(qū)的免疫表位，還將亞洲I型口蹄疫病毒特定免疫表位呈遞到病毒衣殼表面[24]。Liu等使用O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1和A型FMDV的VP2、VP3、VP4構(gòu)建嵌合型VLPs。用該嵌合型VLPs接種的5只豚鼠中的4只完全免受FMDV毒株O/MAY98攻擊[27]。Dong等將FMDV 3D基因的反義RNA包裝入VLPs，ELISA和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明該表位RNA VLPs可以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在小鼠和豚鼠中測(cè)試疫苗的效力，表明該表位RNA VLPs疫苗保護(hù)了40%的乳鼠和85%(17/20)的豚鼠。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明表位RNA VLPs疫苗將來(lái)在探索和開(kāi)發(fā)針對(duì)FMDV的疫苗中具有一定的價(jià)值[28]?？谔阋卟《?FMDV)的7種血清型中，O型占優(yōu)勢(shì)，但其病毒衣殼比其他血清型更敏感，使得在低pH值昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生O型VLP更加困難。Li等開(kāi)發(fā)了一種用于O型FMDV的新型基于VLPs的候選疫苗。該嵌合VLPs由來(lái)自血清O型的VP1和來(lái)自血清Asia I型的病毒衣殼蛋白的片段組成，它以類似于滅活疫苗的功效保護(hù)豚鼠免受FMDV攻擊。這些結(jié)果均表明FMDV結(jié)構(gòu)蛋白能形成VLPs，并具有產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)血清型FMDV特異性反應(yīng)的潛力[29]。

5.2 HBc-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)是HBV的核衣殼蛋白，HBc經(jīng)大腸桿菌重組表達(dá)后可在體外自主包裝成VLPs，并具有強(qiáng)烈的免疫原性。HBc-VLPs是由HBc單體組成的二十面體顆粒，有兩種形態(tài)：由180個(gè)單體組成T=3型顆粒，直徑約30 nm；由240個(gè)單體組成T=4型顆粒，直徑約34 nm[30]，T代表二十面體一個(gè)面上劃分成小型等邊三角形數(shù)目[31]。在HBc-VLPs表面有刺突結(jié)構(gòu)，稱為免疫顯性區(qū)(MIR)，該區(qū)域作為遺傳操作的靶區(qū)域，可用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)的FMDV抗原表位替換或插入，供B淋巴細(xì)胞識(shí)別，誘導(dǎo)針對(duì)插入抗原表位的特異性體液免疫應(yīng)答[32]。

FMDV抗原表位與HBc-VLPs融合的方法有4種：與HBc的N-末端結(jié)合；與HBc的C末端結(jié)合；插入至HBc的MIR區(qū)；通過(guò)連接子(linker)將HBc整合為二聚體，第1個(gè)HBc的MIR區(qū)空置，第2個(gè)MIR區(qū)插入表位。N-末端結(jié)合多肽受到長(zhǎng)度限制，不能超過(guò)50 aa；C末端插入位置選擇在144、149、156位氨基酸，片段長(zhǎng)度不能超過(guò)100 aa，否則會(huì)影響VLPs組裝[33]；而MIR區(qū)域是常用的外源序列插入?yún)^(qū)域，可選擇將外源肽插入至76～82 aa之間或完全替換MIR區(qū)域。HBc-VLPs既可以是胸腺依賴性抗原，又可以是非胸腺依賴性抗原[34]。作為胸腺依賴性抗原時(shí)，HBc所包含的Th細(xì)胞表位可被人體和小鼠識(shí)別，產(chǎn)生針對(duì)HBc和其包含外源抗原的免疫應(yīng)答[35]。HBc可誘導(dǎo)Th細(xì)胞活化，并可產(chǎn)生對(duì)HBc和其攜帶FMDV抗原表位的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，該特征使HBc成為理想的FMD疫苗載體[36]。

1987年，Clarke等[37]首次在《Nature》上發(fā)表使用HBc作為抗原表位載體，將FMDV VP1蛋白第141～160 aa表位多肽融合至HBc的N-末端，實(shí)驗(yàn)表明，該段多肽的免疫原性明顯提高了。姜志剛將亞洲I、O型FMDV抗原表位插入在HBc的MIR區(qū)，利用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，形成嵌合型VLPs，其與相應(yīng)的單抗有強(qiáng)的反應(yīng)活性，說(shuō)明抗原表位被成功地展示在HBc表面[38]。

5.3 PCV2-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的引起豬繁殖障礙等多種疫病的一種重要病原。PCV2是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的無(wú)囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，基因組全長(zhǎng)約為1767 bp，病毒的衣殼蛋白含有一種衣殼蛋白ORF2，60分子的ORF2蛋白可自主組裝產(chǎn)生二十面體對(duì)稱的病毒衣殼結(jié)構(gòu)[39]。

將FMDV VP1 G-H環(huán)與異源病毒衣殼蛋白融合形成病毒粒子嵌合體[40]，有助于擴(kuò)展病毒的抗原譜，提高病毒的免疫原性，將G-H Loop上的線性表位與誘導(dǎo)更強(qiáng)細(xì)胞免疫的載體蛋白結(jié)合可以誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生高比率中和抗體，說(shuō)明強(qiáng)免疫原性的載體蛋白可以增強(qiáng)針對(duì)線性表位的抗體應(yīng)答[41]。李艷麗在PCV2衣殼蛋白長(zhǎng)loop環(huán)CD/EF/GH內(nèi)嵌合FMDV G-H環(huán)，形成的VLPs有利于FMDV中和抗原表位的展示和中和抗體的產(chǎn)生[39]。曹軼梅等將FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的抗原表位插入到PCV2衣殼蛋白的核定位信號(hào)序列中，在大腸桿菌中表達(dá)并獲得嵌合型VLPs，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)PCV2、FMDV均有良好的免疫反應(yīng)，但是有一定的差異，說(shuō)明PCV2衣殼蛋白的N-端不適合插入抗原表位遞呈在表面[42]。張飛雁等將O型FMDV中和表位插入到PCV2的CAP蛋白的C-端，ELISA、電鏡檢測(cè)均表明其成功構(gòu)建嵌合型VLPs，為研制基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)[43]。

5.4 PPV-VLPs作為FMDV抗原表位的載體

豬細(xì)小病毒(PPV)是細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)的成員。PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2在體外表達(dá)系統(tǒng)中能夠組裝成VLPs，在VP2蛋白N端連接外源細(xì)胞抗原表位能裝配成病毒樣顆粒，而且能檢測(cè)到針對(duì)該嵌入抗原的免疫應(yīng)答，這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明PPV-VLPs可以作為外來(lái)抗原的載體，以此構(gòu)建出良好免疫原性和安全性的重組多價(jià)基因工程疫苗[44]。

Dalsqaard等在對(duì)犬細(xì)小病毒4個(gè)loop的插入研究中發(fā)現(xiàn)，loop2插入的重組體不僅能表達(dá)出最多的病毒樣顆粒，而且是唯一能引起免疫應(yīng)答和中和反應(yīng)的重組體[45]。潘群興等將O型FMDV上的抗原表位插入到PPV VP2蛋白不同Loop區(qū)，利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得VLPs，Western Blotting檢測(cè)在有64 kDa大小有特異性條帶，電鏡觀察其組裝成了VLPs[46]。李文麗成功構(gòu)建了嵌合口蹄疫病毒抗原表位的PPV-VLPs，并利用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組蛋白，用其免疫豚鼠獲得了低水平的FMDV抗體[47]。范朋舉將FMDV抗原表位插入了PPV-VP2蛋白表面的5個(gè)不同位點(diǎn)，尋找VP2蛋白上潛在的VLPs組裝非必需區(qū)，結(jié)果顯示在Loop1和C-端插入FMDV抗原表位后沒(méi)有形成VLPs，形成的VLPs使用ELISA檢測(cè)獲得了較高的抗體效價(jià)[1]。

6 影響VLPs展示FMDV抗原表位的因素

6.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇

目前，F(xiàn)MDV衣殼蛋白已成功在原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(桿狀病毒)和多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(牛痘病毒、腺病毒)中重組表達(dá)并組裝成VLPs[7]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他表達(dá)系統(tǒng)不同，其所指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在胞漿中。牛痘病毒作為載體，能攜帶較大的外源DNA片段，進(jìn)行翻譯后加工處理，指導(dǎo)蛋白質(zhì)形成正確的空間結(jié)構(gòu)，運(yùn)輸和分泌表達(dá)的蛋白，但它表達(dá)重組蛋白的效率較低[19]。人腺病毒5型(Ad5)作為載體也應(yīng)用廣泛，該病毒去除E1區(qū)缺少?gòu)?fù)制能力，可以減少野生毒株的負(fù)面影響；去除E3區(qū)可以增加病毒作為載體的攜帶量，主要的優(yōu)點(diǎn)是不與細(xì)胞基因組發(fā)生整合，可以感染處于不同時(shí)期的細(xì)胞，但是其作為載體還需要提升其蛋白表達(dá)量和延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間[48-50]。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能通過(guò)特定酶切位點(diǎn)將多個(gè)基因片段同時(shí)嵌入載體，獲得的重組桿粒能表達(dá)出異源性的多蛋白復(fù)合物，并可對(duì)多蛋白復(fù)合物進(jìn)行翻譯后加工修飾，但其表達(dá)蛋白的時(shí)間較長(zhǎng)，費(fèi)用昂貴[51]。原核表達(dá)系統(tǒng)研究比較完善，其遺傳穩(wěn)定、繁殖周期短，目的蛋白表達(dá)水平和穩(wěn)定性高，但缺乏對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后加工及復(fù)性，形成不溶性蛋白[24]。為使目的蛋白可溶性表達(dá)，研究者們采用SUMO表達(dá)系統(tǒng)及標(biāo)簽蛋白純化技術(shù)，設(shè)計(jì)帶有標(biāo)簽的SUMO蛋白與目的蛋白融合。融合蛋白在大腸桿菌體內(nèi)可溶性表達(dá)后，SUMO蛋白酶特異性識(shí)別并切除帶有標(biāo)簽的SUMO蛋白，可以還原目的蛋白天然構(gòu)象[26]。

6.2 體外組裝緩沖體系

選擇表達(dá)FMDV抗原表位的載體不同，體外組裝成VLPs的條件也會(huì)發(fā)生變化。有報(bào)道顯示，O型FMDV衣殼比其他血清型對(duì)酸更敏感，并且難以在低pH值的昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝[52]。衣殼蛋白體外組裝傾向于疏水作用和共價(jià)鍵結(jié)合，高鹽和高溫條件都會(huì)使溶液疏水作用增強(qiáng)，但衣殼蛋白體外組裝是一個(gè)緩慢過(guò)程，高溫容易使蛋白降解不利于VLPs組裝[26]。溶液酸堿度影響蛋白質(zhì)分子表面電荷狀態(tài)，改變蛋白質(zhì)分子間及蛋白質(zhì)分子與溶液中的粒子之間相互作用力。依據(jù)衣殼蛋白等電點(diǎn)和溶液中的粒子強(qiáng)度調(diào)節(jié)溶液pH值，使衣殼蛋白以天然結(jié)構(gòu)存在并通過(guò)共價(jià)鍵或疏水作用有規(guī)則緩慢聚集成VLPs，中性偏堿或者堿性條件下FMDV-VLPs都能組裝[26]。總體來(lái)說(shuō)，在pH值、溫度、緩沖體系離子強(qiáng)度的綜合影響下，才能使VLPs正確組裝。

6.3 FMDV抗原表位的插入位點(diǎn)和大小

對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，G H loop突出于病毒衣殼表面，包含F(xiàn)MDV的主要抗原表位。研究表明，loop環(huán)中保守的RGD序列與FMDV侵入宿主細(xì)胞密切相關(guān)，且RGD序列兩側(cè)的殘基高度可變，可以作為外源肽段的插入位點(diǎn)。FMDV抗原表位可以與HBc的N-末端結(jié)合，與HBc的C-末端結(jié)合或插入(置換)到HBc的MIR區(qū)[53]。FMDV抗原表位可以插入PCV2衣殼蛋白長(zhǎng)loop環(huán)CD/EF/GH內(nèi)形成嵌合VLPs[28]。PPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2 loop2中插入FMDV抗原表位能表達(dá)出嵌合VLPs[33]。不同的插入位點(diǎn)會(huì)影響FMDV抗原表位在VLPs的展示，進(jìn)而影響其免疫原性。而加入的FMDV抗原表位的大小可能會(huì)導(dǎo)致組裝效率改變，有可能還會(huì)影響VLPs的空間構(gòu)型，導(dǎo)致其不能正確組裝。研究表明，用完整VP1結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的嵌合VLPs比單獨(dú)的VP1中和表位抗原性高許多，它能展示VP1上的所有優(yōu)勢(shì)抗原表位，空間構(gòu)象正確且B細(xì)胞表位完全暴露，組裝成的VLPs有可能正確呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位三級(jí)結(jié)構(gòu)，這樣就可能擁有與FMDV天然病毒粒子相近的免疫效果[12]。

7 討論

口蹄疫在數(shù)百年的流行中，不僅給世界各國(guó)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且其間接損失是無(wú)法估量的。自從發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒粒子以后，抗口蹄疫的研究未曾停止，但是口蹄疫病原變異性極強(qiáng)，7個(gè)血清型之間沒(méi)有交叉免疫，同型內(nèi)不同病毒株的抗原性也不同，新毒株的不斷出現(xiàn)，使疫情不斷出現(xiàn)高潮，這使得口蹄疫難以得到有效的防治。傳統(tǒng)的疫苗為弱毒疫苗和滅活苗，這些疫苗存在散毒和變異的危險(xiǎn)。隨著反向遺傳學(xué)的興起，新型疫苗的研制大步向前，有效解決了散毒和變異的危險(xiǎn)，為制備聯(lián)苗和多價(jià)苗奠定了基礎(chǔ)。

VLPs不含病毒核酸，是制備病毒疫苗較為理想的載體，能夠?qū)⑼庠炊嚯谋砦徽故驹诒砻?，用VLPs制備FMD的亞單位疫苗具有廣闊的研究前景。目前研究較多的幾種VLPs，如FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs都成功作為載體將FMDV抗原表位展示在表面，并獲得了針對(duì)FMDV的保護(hù)力，VLPs既可以與其他危害嚴(yán)重的疾病一起制備為多價(jià)苗，也可以與同血清型病毒一起制備聯(lián)苗。但是常用的幾種表達(dá)系統(tǒng)組裝VLPs的效率低，形成VLPs的各個(gè)基因表達(dá)量不易控制，所以VLPs作為FMDV抗原表位載體的疫苗研制還需要更多的探索。