金鎮(zhèn)雄 唐德志* 肖延華

1．上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032

2．上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海200032

3．筋骨理論與治法教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032

4．井岡山大學(xué)，江西 吉安 343009

現(xiàn)如今，組織工程技術(shù)在骨和軟骨、血管、神經(jīng)、皮膚、肌腱韌帶等組織工程領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。干細(xì)胞(stem cell)是一種未充分分化、尚不成熟的細(xì)胞，具有自我復(fù)制、再生、更新、多向分化等能力的細(xì)胞。正是因?yàn)樗亩喾只芰驮偕鷿摿κ蛊浯罅繎?yīng)用于干細(xì)胞研究和再生醫(yī)學(xué)中［1］。干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩大類，成體干細(xì)胞又可根據(jù)其特定組織來源分為造血干細(xì)胞、骨髓及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞等。其中以骨髓及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在骨科應(yīng)用較為廣泛。隨著年齡的增長(zhǎng)，身體健康的下降或其他因素的影響，內(nèi)在再生潛能下降時(shí)，需要在創(chuàng)新療法方面取得新的進(jìn)展，因此基于細(xì)胞的修復(fù)策略已成為有希望的治療策略［2］。在正常情況下，它們保持靜止?fàn)顟B(tài)。在通過生物信號(hào)刺激時(shí)，例如，由于組織損傷，間充質(zhì)干細(xì)胞被激活并經(jīng)歷對(duì)稱或不對(duì)稱分裂，并且被募集到受損部位以替換或再生受損組織。由于其強(qiáng)大的修復(fù)潛力，間充質(zhì)干細(xì)胞已應(yīng)用于不斷擴(kuò)大的臨床適應(yīng)證，特別是骨缺損和軟骨損失［3］。目前，以干細(xì)胞療法為基礎(chǔ)的骨科相關(guān)疾病治療的基礎(chǔ)研究報(bào)道較多。本文主要從骨髓、脂肪、骨骼肌、滑膜、胚胎源性間充質(zhì)干細(xì)胞等方面介紹不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在骨及軟骨組織疾病的研究進(jìn)展，通過總結(jié)前人卓越的治療方法，為將來的進(jìn)一步研究及臨床運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向成骨、脂肪、軟骨及神經(jīng)樣等細(xì)胞的分化，并且BMSCs以其體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、免疫原性低和具有多向分化的潛能，因此在發(fā)現(xiàn)這種多能細(xì)胞群的50多年來，BMSCs仍然是最受歡迎的種子細(xì)胞。這也使得BMSCs廣泛應(yīng)用于包括軟骨修復(fù)在內(nèi)的骨與軟骨組織等細(xì)胞層次的臨床研究。最近在細(xì)胞標(biāo)記和追蹤方面的技術(shù)進(jìn)步促進(jìn)了對(duì)潛在機(jī)制的研究，這使得能夠追蹤體內(nèi)細(xì)胞群的譜系以研究它們的位置和功能。Park等［4］利用譜系追蹤方法，提出Mx1表達(dá)的骨髓細(xì)胞具有所有已知的BMSCs特征，它們可以遷移到損傷部位，在骨折愈合過程中提供新的成骨細(xì)胞。除巢蛋白和Mx1外，瘦素受體(LepR)是鑒定BMSCs的另一種標(biāo)志物。LepR陽(yáng)性細(xì)胞顯示能夠在骨髓中產(chǎn)生成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞［5］。在骨折模型中，85%的成骨細(xì)胞在8周后顯示來自LepR陽(yáng)性表達(dá)的BMSCs。應(yīng)該注意的是，骨髓中的BMSCs本質(zhì)上是異質(zhì)的。最近，表達(dá)gremlin-1的細(xì)胞從骨髓中分離出來，這些細(xì)胞能夠成骨而不是脂肪形成［6-7］。然而，這些細(xì)胞仍然占骨折愈傷組織中28%的成骨細(xì)胞。此外，Liu等［8］通過遺傳修飾 BMSCs用于骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)遞送開發(fā)了一種新的治療策略。將OPG基因修飾的BMSCs接種在羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)支架上以促進(jìn)卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠中的下頜骨缺損中的骨再生。證明OPG-BMSCs能夠抑制破骨細(xì)胞分化并隨后抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，并且具有骨質(zhì)疏松相關(guān)骨缺損重建應(yīng)用的潛力。Li等［9］揭示了從去卵巢(OVX)大鼠中分離的骨髓來源的BMSCs中miR-140和miR-214的異常高表達(dá)。為了抑制miRNA水平，作者構(gòu)建了表達(dá)miRNA海綿的雜合桿狀病毒載體以拮抗miR-140或miR-214，持續(xù)減弱從OVX大鼠分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞miR-140/miR-214水平，促進(jìn)成骨并增強(qiáng)在體外抑制破骨細(xì)胞成熟的能力，因此為治療骨質(zhì)疏松性骨缺損找到了新的途徑。Xu等［10］將SATB2修飾的BMSCs移植在牙槽骨質(zhì)疏松的OVX大鼠上，結(jié)果顯示，來自卵巢切除誘導(dǎo)的牙槽骨的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出典型的衰老表型，如干燥和骨生成能力減弱，衰老或破骨細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加和脂肪形成能力增強(qiáng)。這些表型變化是SATB2介導(dǎo)衰老的結(jié)果。SATB2是牙槽BMSCs衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其過表達(dá)降低了體外和體內(nèi)這些衰老的變化。SATB2修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可能是治療雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松癥引起的牙槽骨丟失的潛在策略。總之，這些研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨愈合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

BMSCs具有取材容易、易于培養(yǎng)、能夠自我更新增殖和多向分化的潛能等優(yōu)勢(shì)而廣受關(guān)注［11］。并且自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的優(yōu)點(diǎn)包括創(chuàng)傷小、無(wú)排異反應(yīng)、移植后并發(fā)癥少，可有效避免傳統(tǒng)自體骨移植的骨缺損以及愈合延遲情況，骨髓來源穩(wěn)定可靠，可反復(fù)抽取［12］。正因如此，在臨床應(yīng)用上，BMSCs存在著取材難、獲得足夠的原代數(shù)量難、且間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中很少見，收集時(shí)易對(duì)患者帶來二次傷害等不足之處［13］。

2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)能夠廣泛受到關(guān)注，取決于脂肪組織在人體分布廣泛、取材方便等優(yōu)點(diǎn)，易于收獲并存在于幾種類型的脂肪組織中，包括內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪和器官脂肪等。并且ADSCs能多向分化成為中胚層和非中胚層細(xì)胞［14］，廣泛應(yīng)用于心肌梗死修復(fù)、軟骨和骨組織再生、腦組織修復(fù)、傷口愈合、皮膚組織再生、肝臟組織再生、肌肉組織修復(fù)［15］等，為許多疾病提供治療方案。Tang等［16］利用淫羊藿苷聯(lián)合脂肪干細(xì)胞對(duì)去卵巢大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型骨質(zhì)疏松癥的治療進(jìn)行了研究，通過實(shí)驗(yàn)證明淫羊藿苷與干細(xì)胞結(jié)合顯著降低了卵巢切除術(shù)引起的體重增加，明顯降低了堿性磷酸酶、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶和骨骼γ-羧基谷氨酸蛋白含量，顯著增加了骨鈣蛋白的含量，并且提高腰椎和股骨的骨密度。在臨床研究上，ADSCs的第一次臨床應(yīng)用是在2004年。根據(jù)美國(guó)臨床試驗(yàn)報(bào)道，有121項(xiàng)研究注冊(cè)使用ADSCs，這些研究包括治療軟組織填充和骨組織缺損、脂肪代謝障礙、糖尿病、心血管疾病、肝硬化、移植物抗宿主病、克羅恩病、動(dòng)脈硬化和肌萎縮側(cè)索硬化等［17］。

然而，如果目標(biāo)是軟骨內(nèi)骨折愈合，ADSCs應(yīng)該謹(jǐn)慎使用，因?yàn)锳DSCs可以產(chǎn)生抑制軟骨細(xì)胞增殖和刺激軟骨細(xì)胞凋亡的因子［18］，并且關(guān)于ADSCs的腫瘤增強(qiáng)特性的報(bào)告也要求臨床應(yīng)用中使用ADSCs時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。此外，有學(xué)者報(bào)道了不同解剖部位分離的ADSCs的分化潛能以及供體性別和年齡都具有顯著差異［19］。雖然ADSCs的研究面臨種種困難，但其含量豐富，易分離獲取，過程相對(duì)簡(jiǎn)單，是分離培養(yǎng)ADSCs的一個(gè)可靠來源，使得ADSCs在再生醫(yī)學(xué)中仍然是一個(gè)非常有前景的方法，相信在未來ADSCs將使更多的患者受益。

3 骨骼肌間充質(zhì)干細(xì)胞

骨骼肌來源的間充質(zhì)干細(xì)胞主要包括肌衛(wèi)星細(xì)胞(muscle satellite cells)和肌源性干細(xì)胞(muscle derived stem cells，MDSCs)［20］。肌衛(wèi)星細(xì)胞黏附在肌纖維上，位于肌膜和基底膜之間，正常情況下處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，但在骨折創(chuàng)傷后可顯示多能間充質(zhì)干細(xì)胞活性，分化為成肌細(xì)胞(myoblast)和成骨細(xì)胞(osteoblast)，并且表達(dá)特異性的標(biāo)記蛋白Pax7［21］。Pax7是肌衛(wèi)星細(xì)胞重要的分子標(biāo)記，在胚胎發(fā)育過程中決定衛(wèi)星細(xì)胞的形成。而從受傷的骨骼肌纖維分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在不含成骨誘導(dǎo)劑的條件下，仍可分化為成骨細(xì)胞［22］，表現(xiàn)為 ALP、Col1和Runx2及SP7/Osterix等成骨標(biāo)志基因的高表達(dá)。這些結(jié)果表明，骨骼肌受到損傷之后，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以被激活向成肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。

肌源性干細(xì)胞是存在于骨骼肌并可從中分離出來的后天干細(xì)胞，具有長(zhǎng)期增殖、高度自我更新和多向分化的特點(diǎn)。與其他間充質(zhì)干細(xì)胞相比，MDSCs在體外培養(yǎng)具有良好的增殖和分化能力等優(yōu)點(diǎn)。MDSCs也具有向成骨細(xì)胞分化的能力，但是這方面的研究卻鮮有報(bào)道。Xiang等［23］發(fā)現(xiàn)在含有BMP-9的培養(yǎng)基條件下，純化的MDSCs能向成骨細(xì)胞分化，發(fā)生礦化并形成骨組織。

骨骼肌來源間充質(zhì)干細(xì)胞既能向成肌細(xì)胞分化，也能向成骨細(xì)胞分化，而對(duì)于“肌少-骨質(zhì)疏松癥”這一肌肉骨骼相關(guān)的退行性疾病［24］，由于缺乏具有明確療效的治療藥物，利用骨骼肌來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療可能成為一種潛在的新治療策略。

4 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞

自首次從膝關(guān)節(jié)附近滑膜中分離出滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs)以來，其在組織工程動(dòng)物模型的研究中逐日增加，可作為軟骨損傷、骨損傷及韌帶損傷等組織工程中的種子細(xì)胞。通過 Trounson等［25］與 Kondo等［26］的研究表明，SMSCs可以從正常或骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中獲得，其與軟骨細(xì)胞有相似的基因表達(dá)譜，這表明與其他間充質(zhì)干細(xì)胞相比，SMSCs成軟骨分化能力更強(qiáng)。張聘等［27］研究結(jié)果表明，利用miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-202-3p表達(dá)明顯降低，抑制miR-202-3p的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)SMSCs增殖。此外，Eva等［28］在體外跨孔單層共培養(yǎng)中，研究SMSCs和軟骨細(xì)胞(chondrocytes，CHDR)相互作用，使用組織學(xué)、免疫染色或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定分析蛋白質(zhì)表達(dá)，結(jié)果顯示，SMSCs與CHDR共培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞聚集，隨后，細(xì)胞形成球體并失去粘附，熒光標(biāo)記顯示同時(shí)出現(xiàn)II型膠原蛋白表達(dá)。然而，當(dāng)單獨(dú)培養(yǎng)SMSCs時(shí)未觀察到這種現(xiàn)象。因此，CHDR的旁分泌作用在SMSCs中誘導(dǎo)軟骨形成表型，可能模仿關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)。這種共培養(yǎng)方法可以更好地理解細(xì)胞相互作用以及對(duì)軟骨修復(fù)程序的潛在影響。

SMSCs通常取自自體并且極易誘導(dǎo)分化，較少會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。正是如此，SMSCs已被認(rèn)為是修復(fù)軟骨損傷的最為理想的種子細(xì)胞［29］。

5 圍產(chǎn)期組織間充質(zhì)干細(xì)胞

當(dāng)前針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用上，最受歡迎的是BMSCs，但是獲取骨髓是有創(chuàng)的，以及道德倫理問題，嚴(yán)重影響了BMSCs治療在臨床上的進(jìn)展。并且成人骨髓和脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞需要有侵入性的采集方法，而且只能以少量的方式獲得。骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力隨供體年齡和分化能力的降低而降低［30］。除這些熱門干細(xì)胞外，胚胎干細(xì)胞具有較大的增殖和分化能力，但是涉及倫理學(xué)問題。因此，圍產(chǎn)期組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞受到廣泛關(guān)注，如人胎盤、臍帶、羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞。

5.1 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞

在圍產(chǎn)期組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂能力最強(qiáng)，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta mesenchymal stem cells，hP-MSCs)成骨能力最好［31］。這項(xiàng)研究對(duì)hP-MSCs進(jìn)一步應(yīng)用于骨及軟骨病的治療起到了一定的推動(dòng)作用。并且hPMSCs可能通過抑制 IL-6、TNF-α、IL-1β 水平、MMPs分泌、CDH11表達(dá)及上調(diào)TGF-β水平，來減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥與軟骨破壞［32］。以hPMSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨可能會(huì)成為細(xì)胞療法的潛在來源。

hP-MSCs可大量獲得，具有增殖和分化能力，已逐漸成為應(yīng)用前景廣闊的種子細(xì)胞。目前胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的研究尚處于初級(jí)階段，其分離純化及鑒定尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，仍需進(jìn)一步探討。且hP-MSCs的原代培養(yǎng)，胰酶冷消化法具有明顯優(yōu)勢(shì)，但較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更為困難，對(duì)無(wú)菌條件及胎盤組織的新鮮度的要求較高。

5.2 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood mesenchymal stemcells，UCB-MSCs)具有來源含量高、免疫原性低、道德倫理爭(zhēng)議少等諸多優(yōu)點(diǎn)［33］。并且通過移植UCB-MSCs在脊髓受損部位能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生，對(duì)脊髓損傷性疾病及脊髓受傷后機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能障礙等療效顯著，比起當(dāng)前藥物治療更多只是延緩損傷進(jìn)展相比，明顯提高患者今后的生存質(zhì)量［34］。Lee 等［35］發(fā)現(xiàn)，由臍血組織誘導(dǎo)成的CD34+細(xì)胞可以顯著增強(qiáng)骨沉積及骨密度，并改善骨的顯微結(jié)構(gòu)，同時(shí)可以抑制破骨細(xì)胞的分化。趙剛等［36］研究表明，相對(duì)自體BMSCs作為骨組織工程治療骨缺損存在諸多不足之處外，UCB-MSCs與BMSCs誘導(dǎo)組基因表達(dá)相一致，因此，表明UCBMSCs可替代BMSCs作為理想的種子細(xì)胞來治療骨相關(guān)疾病。

然而，UCB-MSCs的生存壽命有限，對(duì)生存環(huán)境要求較高，體外培養(yǎng)周期長(zhǎng)、儲(chǔ)存難度大等方面的問題，對(duì)其在臨床治療產(chǎn)生阻礙，且具有一定的安全性問題，需在移植前對(duì)細(xì)胞的活力和內(nèi)毒素進(jìn)行檢測(cè)。雖有研究表明UCB-MSCs體內(nèi)移植后的致瘤潛能很低［37］，但仍需謹(jǐn)慎，否則可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重不良后果。隨著對(duì) UCB-MSCs研究的不斷深入，提高 UCBMSCs成軟骨分化能力，這些問題終會(huì)得到解決。

5.3 羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞

羊膜也是間充質(zhì)干細(xì)胞的來源之一。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(amnion-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)具有自分泌或旁分泌能力，其更新能力強(qiáng)，具有獨(dú)特的胎盤屏障。Topoluk等［38］研究發(fā)現(xiàn)，AMSCs對(duì)比骨髓及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)量高，可減少體外擴(kuò)增數(shù)目。Topoluk還提及，AMSCs與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相比，可以加速成骨和成軟骨分化，具有軟骨細(xì)胞外基質(zhì)再生能力。

但是目前利用AMSCs促進(jìn)骨細(xì)胞分化成熟的相關(guān)研究缺乏，采用移植AMSCs治療骨質(zhì)疏松很可能為骨質(zhì)疏松癥的治療打開新的視野。雷鳴等［39］發(fā)現(xiàn)AMSCs移植對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有治療作用，可能是通過促進(jìn)Runx2、Osterix表達(dá)發(fā)揮作用。并且作者利用AMSCs與蝦青素、唑來膦酸等聯(lián)合治療去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠，可以明顯提高骨密度，增加骨強(qiáng)度。AMSCs在修復(fù)骨及軟骨等方面所表現(xiàn)出的無(wú)限潛能，或在將來成為骨及軟骨疾病在臨床上的新細(xì)胞療法。

6 展望

迄今為止，間充質(zhì)干細(xì)胞在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展迅速、可提升空間大，涉及干細(xì)胞修復(fù)骨、軟骨、椎間盤等多項(xiàng)領(lǐng)域，每個(gè)領(lǐng)域都取得了大大小小的進(jìn)展。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞在骨科疾病治療中的地位越來越重要。然而，大多數(shù)的間充質(zhì)干細(xì)胞治療策略仍停留在體外研究階段，在臨床應(yīng)用方面還面臨著諸多問題［40］，對(duì)各種間充質(zhì)干細(xì)胞的分化機(jī)理尚不明確，這使研究人員對(duì)其定向分化無(wú)法進(jìn)行精確把控，且存在諸多限制骨再生的幾個(gè)因素，包括早期炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)組成、患者年齡、損傷類型、生理適應(yīng)和血管生成能力將在很大程度上影響治療的短期和長(zhǎng)期成功［41-42］。通常，移植物的成功依賴于能夠形成所需組織的有效種子細(xì)胞群的選擇，以及隨后的刺激提示以構(gòu)建和支持這些細(xì)胞。因此，目前間充質(zhì)干細(xì)胞療法中缺乏令人信服的療效仍然是與研究設(shè)計(jì)的相關(guān)問題。此外，關(guān)于體外擴(kuò)增種群如何代表原始天然細(xì)胞種群的知之甚少。因此，尚不清楚體外擴(kuò)增的種子細(xì)胞是完全還是僅部分代表供體人群屬性［43］。當(dāng)然，身為臨床醫(yī)生也不要因?yàn)槊媾R諸多問題而排斥這種方法，可以將這種方法與傳統(tǒng)的手術(shù)治療與保守治療方式相結(jié)合，也許能取得更好的療效。另外，可結(jié)合當(dāng)今熱門的3D生物打印技術(shù)為間充質(zhì)干細(xì)胞提供與細(xì)胞外基質(zhì)相似的環(huán)境，并且還具有可生物降解的優(yōu)勢(shì)［44-45］。雖然所有研究仍處于研究階段，但鑒于該領(lǐng)域的研究越來越多，相信在未來基礎(chǔ)科學(xué)以及臨床科學(xué)的研究中，間充質(zhì)干細(xì)胞移植在治療骨與軟骨組織等疾病領(lǐng)域有著非常好的應(yīng)用前景，如骨骼肌間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨質(zhì)疏松性骨折、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨關(guān)節(jié)炎等。