楊希娟，黨 斌，樊明濤*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.青海大學(xué) 青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，青海 西寧 810016）

臨床試驗和流行病學(xué)研究表明日常膳食中攝入一定量全谷物可有效預(yù)防多種慢性疾病，如心血管疾病和癌癥等。研究認(rèn)為全谷物與氧化應(yīng)激相關(guān)的慢性病有密切關(guān)系，在一定程度上有助于緩和慢性病的發(fā)展[1-3]。而全谷物中的酚類物質(zhì)作為重要的膳食抗氧化組分，具有預(yù)防機體氧化應(yīng)激的功效，對人類的心血管疾病、糖尿病、肥胖和腫瘤等具有突出的防護作用[4-6]。青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.）是大麥的一種，因其籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故稱裸大麥[7]。生長在海拔約1 400～4 700 m的青藏高原，是青藏高原區(qū)域第一大作物和藏區(qū)農(nóng)牧民賴以生存的主要口糧[8-9]。多酚是大麥中一類豐富的次級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)有研究指出大麥中的酚類物質(zhì)含量（0.2%～0.4%）遠(yuǎn)高于其他谷物[10]，并研究報道了不同種類、不同顏色大麥中多酚的組成、含量及抗氧化活性[11]。但是已有報道多關(guān)注的是皮大麥，而關(guān)于青藏高原區(qū)域生長的青稞中多酚的含量及其活性研究較少。

可食植物中天然存在的大部分多酚都是以游離或結(jié)合的形式存在，且不同植物的化學(xué)組成差異導(dǎo)致不同植物中多酚的最適提取溶劑不同[12-13]?，F(xiàn)已有研究證明提取溶劑及方法對大麥[14]、荔枝果肉[15]、紅薯葉[16]、石榴果肉[17]等不同植物資源中多酚含量及抗氧化活性有顯著影響，但是關(guān)于提取溶劑對青稞中多酚含量及抗氧化活性影響的報道較少。申迎賓等[4]研究提取溶劑對青稞提取物總酚、黃酮含量及其抗氧化活性的影響，忽略了提取溶劑對結(jié)合酚的影響；徐菲等[18]研究青稞結(jié)合酚的提取優(yōu)化工藝，但其以青稞麩皮為原料，未考慮溶劑對青稞全谷物中結(jié)合酚的影響，且鮮見不同溶劑提取對青稞不同形態(tài)多酚組成影響的深入報道。因此，本研究以4 個不同品種青稞為原料，系統(tǒng)研究不同提取溶劑對青稞游離酚及結(jié)合酚組成與抗氧化活性的影響。旨在建立適于青稞全谷物游離酚和結(jié)合酚提取的方法，為青稞中多酚類物質(zhì)及功能性全谷物食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞品種：13YN-5、946、瓦藍(lán)、昆侖15號，均由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物育種栽培研究所青稞研究室提供。樣品收獲后脫粒，室溫晾干，去除顆粒石子。用萬能粉碎機將青稞種子粉碎，過60 目篩得青稞全谷物粉。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、水溶性VE（Trolox）、2,2’-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 美國Sigma公司；沒食子酸、根皮酚、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、2,4-二羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、水楊酸、苯甲酸、藜蘆酸、鄰香豆酸、蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、楊梅素、槲皮素、柚皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%） 上海源葉生物科技有限公司；福林-酚試劑（優(yōu)級純） 北京索萊寶科技有限公司；丙酮、正己烷、甲醇、氫氧化鈉、硫酸、乙酸乙酯、碳酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5430R離心機 德國艾本德公司；Retavapor R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi有限公司；N4S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠；FW-100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機 昆山市超聲波儀器有限公司；600E-2487高效液相色譜儀 美國沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞游離酚的提取

稱取不同品種的青稞全粉1 g，分別加入25 mL 80%甲醇溶液、80%乙醇溶液、80%丙酮溶液及純水，室溫條件下500 W超聲波處理30 min，離心（4 000 r/min，20 min），收集上清液，殘渣用同樣方法提取2 次，合并3 次上清液，45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，沉淀物用甲醇定容至10 mL，0.45 μm有機膜過濾，得青稞游離酚類物質(zhì)提取液，－20 ℃避光保存[19]。

1.3.2 青稞結(jié)合酚的提取

1.3.2.1 堿法

向提取過游離酚的殘渣（1 g）中加入20 mL正己烷，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，向沉淀物中加入20 mL 2 mol/L NaOH溶液，充入氮氣密封后在室溫條件下振蕩1 h。所得水解液用濃HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至1，再用20 mL乙酸乙酯萃取5 次，離心（3 000 r/min，5 min），合并乙酸乙酯萃取相，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用甲醇定容至10 mL，0.45 μm有機膜過濾，得青稞結(jié)合酚類物質(zhì)提取液，－20 ℃避光保存[20]。

1.3.2.2 酸法

向提取過游離酚的殘渣（1 g）中加入20 mL正己烷，振蕩后離心（2 000 r/min，5 min）棄去上清液，向沉淀物中加入15 mL 10%甲醇-硫酸溶液，70 ℃水浴1 h。用20 mL乙酸乙酯萃取5 次，離心（2 000 r/min，5 min），合并乙酸乙酯萃取相，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用甲醇定容至10 mL，0.45 μm有機膜過濾，得青稞結(jié)合酚類物質(zhì)提取液，－20 ℃避光保存[19-21]。

1.3.3 青稞酚類物質(zhì)含量測定

1.3.3.1 青稞提取物中酚含量的測定

采用福林-酚測定法[18,21]。吸取樣品提取液125 μL于試管中，再加入500 μL蒸餾水和125 μL福林-酚試劑，搖勻，反應(yīng)6 min后加入1.25 mL 7% Na2CO3溶液，再加入1 mL蒸餾水，室溫條件下避光放置1.5 h后，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長760 nm處測定吸光度，重復(fù)3 次。配制不同濃度梯度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偡雍恳悦?00 g提取物（干基）中沒食子酸當(dāng)量計（mg/100 g）。

1.3.3.2 青稞提取物中黃酮含量的測定

吸取100 μL樣品提取液于試管中，加入5% NaNO2溶液200 μL，搖勻，6 min后加入10% Al(NO3)3溶液200 μL，搖勻，6 min后再加入4% NaOH溶液2 mL，室溫避光放置15 min后，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長510 nm處測定吸光度，重復(fù)3 次。配制不同溶度梯度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傸S酮含量以每100 g提取物（干基）中兒茶素當(dāng)量計（mg/100 g）[18,21]。

1.3.4 高效液相色譜定量分析方法

采用高效液相色譜法對不同方法提取的青稞游離酚與結(jié)合酚提取液進(jìn)行分析[11]。色譜條件：C18制備色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.1%冰醋酸，流動相B為含0.1%冰醋酸的乙腈溶劑；梯度洗脫：0 min，8% B，92% A；2 min，10% B，90% A；27 min，30% B，70% A；50 min，90% B，10% A；52～56 min，100% B；56～60 min，8% B，92% A。流速0.8 mL/min；紫外檢測波長280 nm；進(jìn)樣量20 μL；運行時間60 min。

通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間比較，確定色譜峰所屬化合物種類，通過峰面積計算化合物含量，結(jié)果以干基表示（μg/g）。

1.3.5 青稞酚類物質(zhì)抗氧化活性測定

1.3.5.1 清除DPPH自由基能力測定

吸取樣品提取液1 mL于試管中，再加入4.5 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長517 nm處測定吸光度，重復(fù)3 次。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=－0.004 2X+0.916 3（0～140 μmol/L，R2=0.992 8）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算DPPH自由基清除能力，以每100 g提取物（干基）中Trolox當(dāng)量計（μmol/100 g）[20-21]。

這給我父親長了臉，歪嘴的次數(shù)一多，人居然可以坐起來，雖口齒不清，也能表達(dá)出個大概。春節(jié)祭祖，族親婚娶，他硬要去呢。用輪椅推到祠堂，我站前排、坐上席，他擠在人堆里。我心里蠻別扭，他倒是開心得很。我當(dāng)校長那年，幾次喝喜酒，都被請入上席首座，真是受寵若驚呀，面對族長和那些老成，忐忑不安，一餐飯要掉好幾次筷子，李打油干脆抓一把筷子放在我背后的供案上。我父親每每看到這個細(xì)節(jié)，嘴就跑到耳朵家去了。

1.3.5.2 鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

FRAP工作液的配制：300 mmol/L pH 3.6的醋酸鈉緩沖液（3.076 2 g C2H3NaO2加20 mL C2H4O2，用蒸餾水定容至250 mL）、10 mmol/L TPTZ溶液（0.156 2 g TPTZ用40 mmol/L鹽酸溶液定容至100 mL）和20 mmol/L FeCl3溶液，按照體積比10∶1∶1的比例混合，于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱備用。

測定方法：吸取樣品提取液50 μL于試管中，再加入4.5 mL FRAP工作液，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長593 nm處測定吸光度，重復(fù)3 次。以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.007 2X－0.001 2（0～300 μmol/L，R2=0.999 2），其中，Y為吸光度，X為Trolox濃度（μmol/L）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品提取液的FRAP，以每100 g提取物（干基）中Trolox當(dāng)量計（μmol/100 g）[21]。

1.3.5.3 ABTS+·清除能力測定

ABTS工作液的配制：將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫避光條件下靜置12～16 h，得ABTS儲備液。將此儲備液按適當(dāng)比例（1∶100，V/V）與無水甲醇混合，要求其在波長734 nm處的吸光度達(dá)到0.7±0.02，得到ABTS工作液，備用。

測定方法：吸取樣品提取液200 μL于試管中，再加入4 mL ABTS工作液，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長734 nm處測定吸光度，重復(fù)3 次。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，波長734 nm處測定的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=－0.001X+0.624 2（0～300 μmol/L，R2=0.990 7）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品提取液清除ABTS+·能力，以每100 g提取物（干基）中Trolox當(dāng)量計（μmol/100 g）[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品每個指標(biāo)重復(fù)測定3 次，所有結(jié)果以 ±s表示。不同溶劑提取青稞游離酚與結(jié)合酚結(jié)果比較用單因素方差分析，SPSS 21.0軟件進(jìn)行SNK-q檢驗。抗氧化能力比較采用單因素方差分析，DPS 7.05軟件進(jìn)行最小顯著差異法檢驗，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對青稞中不同形態(tài)多酚含量的影響

2.1.1 提取溶劑對青稞中游離態(tài)多酚含量的影響

表1 提取溶劑對青稞提取物游離酚、黃酮含量的影響Table 1 Contents of free phenolics and flavonoids in different solvent extracts from hulless barley mg/100 g

2.1.2 溶劑提取對青稞中結(jié)合態(tài)多酚含量的影響

表2 水解方法對青稞提取物結(jié)合酚、黃酮含量的影響Table 2 Effect of hydrolysis methods on contents of bound phenolics and flavonoids in hulless barley extract mg/100 g

如表2所示，酸法提取青稞中結(jié)合酚（172.97～219.26 mg/100 g）、結(jié)合黃酮含量（10.73～23.27 mg/100 g）均顯著（P＜0.05）高于堿法提取液，分別是堿法提取液中含量的1.9～3.1 倍和1.3～2.9 倍。

當(dāng)前，堿水解法被廣泛應(yīng)用于水解植物材料中的結(jié)合酚[20,22-25]，然而本研究發(fā)現(xiàn)酸法水解青稞中的結(jié)合酚，其總酚、總黃酮含量均顯著高于堿法（P＜0.05）。有研究報道表明，酸法水解的蘋果[26]、桃子[26]、荔枝果肉[15]的結(jié)合酚含量較堿法高。因為酸法水解過程采用的高溫更有利于釋放出被包埋在核內(nèi)或偶聯(lián)至細(xì)胞壁膳食纖維或蛋白質(zhì)上的結(jié)合酚類化合物[26-27]。因此，酸水解法較堿水解法更適于提取青稞籽粒中的結(jié)合酚和結(jié)合黃酮化合物。

2.2 提取溶劑對青稞中不同形態(tài)多酚組成及含量的影響

2.2.1 提取溶劑對青稞中游離酚類化合物組成及含量的影響

不同溶劑提取的不同品種青稞中游離酚、黃酮的組成及含量如圖1、表3所示。由表3可知，參試青稞的80%丙酮溶液提取物中檢測到酚類物質(zhì)的組成種類最多為8～18 種，其次為80%甲醇溶液提取物（8～15 種）、80%乙醇溶液提取物（7～13 種），最后為純水提取物（4～13 種），說明有色青稞具有更為豐富的酚類化合物組成，與前人報道[28-29]一致。且參試青稞的80%丙酮溶液提取物中總酚類化合物含量最高，顯著高于（P＜0.05）其他提取溶劑提取液，分別是80%甲醇溶液、80%乙醇溶液與純水提取物的1.08～2.55、1.28～2.60 倍和2.16～4.52 倍。

利用高效液相色譜檢測到4 種溶劑提取的參試青稞13 種酚酸和8 種黃酮。由表4可知，根皮酚、2,4-二羥基苯甲酸僅在80%丙酮溶液提取物及80%甲醇溶液提取物中檢出，沒食子酸僅在80%丙酮溶液提取物中檢出，楊梅素在80%丙酮溶液提取物中未檢出，丁香酸和槲皮素在純水提取物中未檢出。兒茶素在80%丙酮溶液、80%甲醇溶液及80%乙醇溶液中平均含量分別為37.39、38.51、30.24 μg/g，提示這3 種溶劑體系對兒茶素的提取能力相當(dāng)，分別為水提物的3.9、4.0、3.2 倍；綠原酸在80%丙酮溶液及80%乙醇溶液提取物中含量無顯著差異（P＞0.05），揭示這2 種溶劑體系對綠原酸的提取能力相當(dāng)。苯甲酸、藜蘆酸、柚皮素、橙皮苷、槲皮素、蘆丁在80%丙酮溶液提取物中含量顯著高于其他溶劑（P＜0.05），說明80%丙酮溶液更容易富集青稞中黃烷酮、黃烷醇類物質(zhì)；2,4-二羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸與山柰酚含量在80%甲醇溶液提取物中顯著高于其他溶劑（P＜0.05），說明80%甲醇溶液提取更容易富集羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸類及黃酮醇類物質(zhì)；楊梅素在80%乙醇溶液提取物顯著高于其他溶劑（P＜0.05），而純水中的水楊酸平均含量（11.07 μg/g）顯著高于其他溶劑（P＜0.05）。不同提取溶劑對不同種類單體酚的富集及提取效率不同，80%丙酮溶液能更多地提取出不同品種青稞中的游離酚類化合物，是一種高效提取青稞中游離酚類化合物的溶劑。該結(jié)果與前人報道[19-20]的丙酮溶液提取植物中游離態(tài)多酚的能力強于甲醇溶液與乙醇溶液相一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)與其他酚類化合物相比，阿魏酸、鄰香豆酸、香草酸、丁香酸、水楊酸、柚皮苷、橙皮苷、楊梅素在參試青稞游離態(tài)提取物中具有較低的含量。

圖1 青稞高效液相色譜圖Fig. 1 Chromatograms of phenolic compounds in different varieties of hulless barley

表4 溶劑提取4 種青稞游離酚的平均含量Table 4 Average contents of free phenolics extracted from 4 varieties of hulless barley with different solvents μg/g

苯甲酸 33.43±61.00a 20.24±36.44b 18.05±30.65c 11.90±14.34d鄰香豆酸 2.56±5.11c 8.60±6.83a 7.20±4.88b 8.56±1.07a藜蘆酸 15.28±6.55a 9.95±0.82b 8.84±2.35c 4.96±5.73d兒茶素 37.39±25.57a 38.51±21.80a 30.24±12.59b 9.60±11.88c柚皮苷 4.20±3.09a 2.82±1.98c 3.82±2.69b 1.06±2.12d橙皮苷 7.03±8.03a 0.97±1.94c 1.26±1.46b 1.37±1.62b楊梅素 ND 1.14±2.28b 3.16±6.32a 0.82±1.65c槲皮素 20.63±33.46a 3.00±6.00b 2.45±4.89b ND柚皮素 10.00±5.33a 5.64±4.84c 6.53±4.44b 3.47±2.94d山柰酚 5.31±6.75b 8.61±3.01a 5.39±3.59b 1.77±3.53c蘆丁 11.41±4.71a 5.24±6.43c 8.82±0.96b 0.98±1.95d

2.2.2 提取方法對青稞結(jié)合酚類化合物組成及含量的影響

表5 青稞結(jié)合酚的組成及含量Table 5 Bound phenolic composition and content of hulless barleyμg/g

由表5可知，參試青稞的酸法水解物中結(jié)合總酚化合物含量為2 302.32～3 443.19 μg/g，是堿法的2.23～3.11 倍。根皮酚、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸在參試青稞的堿法提取物中均未檢出，綠原酸在所有參試青稞的酸法提取物中也未檢出。參試4 種青稞中水楊酸在堿法提取物中的含量為422.38～703.91 μg/g，是酸法提取物的25.77～60.44 倍。13YN-5和瓦藍(lán)青稞中的阿魏酸，946、昆侖15號青稞中的蘆丁，946中的柚皮苷在堿法中顯著高于酸法（P＜0.05），其余大部分結(jié)合態(tài)單體酚在酸法水解物中的含量均顯著高于堿法（P＜0.05）。由此可見酸法更有利于釋放出更多酚類物質(zhì)，是水解青稞結(jié)合酚的有效方法。單體酚含量分析發(fā)現(xiàn)，水楊酸是堿法水解參試青稞的主要結(jié)合酚種類，沒食子酸、p-香豆酸、丁香酸、苯甲酸、藜蘆酸、橙皮苷是酸法水解青稞的主要結(jié)合酚種類。所有酚類化合物中，根皮酚、2,4-二羥基苯甲酸、原兒茶素、鄰香豆酸、阿魏酸、楊梅素、柚皮素、山柰酚在參試青稞的堿法及酸法提取物中均具有相對較少的含量。

2.3 青稞不同形態(tài)多酚抗氧化活性比較

2.3.1 提取溶劑對青稞游離酚抗氧化活性的影響

圖2 提取方法對不同品種青稞游離酚提取物的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activity of free phenolic compounds extracted from different varieties of hulless barley with different solvents

如圖2所示，4 個青稞的80%丙酮溶液提取物DPPH自由基清除能力為852.56～1 484.18 μmol/100 g，其次為80%乙醇溶液提取物（266.15～603.19 μmol/100 g），80%甲醇溶液提取物（407.09～550.91 μmol/100 g），純水提取物清除DPPH自由基的能力最弱（56.60～216.24 μmol/100 g）；不同溶劑提取物的FRAP與清除DPPH自由基的規(guī)律一致，均為80%丙酮溶液提取物的抗氧化能力最強，顯著高于其他溶劑（P＜0.05），其次為80%乙醇溶液提取物，80%甲醇溶液提取物和純水提取物。其中80%丙酮溶液提取物FRAP為1 250.55～2 041.16 μmol/100 g，清除ABTS+?能力為358.93～518.09 μmol/100 g。此結(jié)果與部分學(xué)者研究報道[19]的結(jié)果一致。

此外，同一溶劑提?。ǔ嵬猓┑牟煌贩N青稞清除DPPH自由基能力均表現(xiàn)出青稞946為最高，瓦藍(lán)、昆侖15號次之，13YN-5最低；80%丙酮溶液和純水提取4 個不同品種青稞游離酚的FRAP表現(xiàn)為13YN-5最高，瓦藍(lán)青稞最低，80%甲醇溶液和80%乙醇溶液提取物的FRAP表現(xiàn)為昆侖15號最高，13YN-5最低。不同品種青稞的抗氧化活性在不同溶劑提取中的差異，一定程度上是不同品種青稞中酚類物質(zhì)組成及含量差異所致。其中青稞946、瓦藍(lán)、昆侖15號的80%丙酮溶液、80%甲醇溶液、80%乙醇溶液提取物清除ABTS+·能力溶劑間差異不顯著（P＞0.05），究其原因與3 種青稞在不同溶劑中的多酚組成及含量有關(guān)，青稞946的80%丙酮溶液、80%甲醇溶液和80%乙醇溶液中均檢測到含量相當(dāng)?shù)拈纹に嘏c柚皮苷，瓦藍(lán)青稞在3 種溶劑中均檢測到含量相當(dāng)?shù)木G原酸、藜蘆酸和柚皮苷，昆侖15號中均檢測到相當(dāng)含量的綠原酸，因此可以初步推斷綠原酸、槲皮素、藜蘆酸、柚皮苷是不同溶劑提取物中清除ABTS+·能力的主要貢獻(xiàn)者。以清除DPPH自由基、FRAP、清除ABTS+·能力為衡量指標(biāo)，80%丙酮溶液更適合作為不同品種青稞中游離酚的提取溶劑，此結(jié)果與提取溶劑對青稞游離酚含量的影響結(jié)果相一致，說明多酚類化合物含量與天然植物提取物抗氧化活性有一定的相關(guān)性[30]。

2.3.2 堿法及酸法水解對青稞結(jié)合酚抗氧化活性的影響

圖3 不同方法提取不同品種青稞結(jié)合酚的抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activity of bound phenolics extracted from differentvarieties of hulless barley with different solvents

如圖3所示，酸法水解物抗氧化活性顯著高于堿法（P＜0.05）。酸法水解不同品種青稞13YN-5、946、瓦藍(lán)、昆侖15號結(jié)合酚DPPH自由基清除能力、FRAP、ABTS+·清除能力分別為3 142.77～3 505.11、1 266.52～2 021.45、1 401.13～1 850.43 μmol/100 g，是堿法水解的7.6～10.3、1.2～1.8 倍和1.1～1.3 倍。這與酸法水解物含有豐富的酚類化合物有關(guān)。因此，以清除DPPH自由基能力、FRAP、清除ABTS+·能力為衡量指標(biāo)，酸法水解更適合作為青稞中結(jié)合酚的提取溶劑。

3 討 論

3.1 提取溶劑對青稞不同形態(tài)多酚提取效果及抗氧化活性的影響

由于不同植物的化學(xué)組成差異會導(dǎo)致不同植物中多酚的最適提取溶劑不同[12-13]，因此選取合適的溶劑從植物材料中提取酚類物質(zhì)是非常重要的，因為不同溶劑對不同酚類物質(zhì)提取能力不同，因此其提取效率差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)80%丙酮溶液較其他3 種溶劑具有較好的提取青稞全谷物中游離態(tài)總酚、總黃酮的能力，其提取液中含有較多的游離態(tài)單體多酚。此研究結(jié)果與Zhao Haifeng[19]、陸健[14]等的研究結(jié)果一致，其比較丙酮溶液、甲醇溶液、乙醇溶液及純水提取不同品種皮大麥中總酚、總黃酮等酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)丙酮溶液提取效果最好，且具有較強的DPPH自由基、ABTS+?、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力。然而申迎賓等[4]考察了水、60%乙醇溶液、60%甲醇溶液、60%丙酮溶液、60%乙醇溶液、100%甲醇、100%丙酮對不同品種青稞中總酚、總黃酮含量及抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)95%乙醇溶液和60%丙酮溶液更有利于青稞多酚的提取，且不同青稞品種中多酚含量及抗氧化活性對溶劑的選擇具有差異，60%乙醇溶液的提取液清除DPPH自由基能力最強，60%丙酮溶液提取液具有最強的ABTS+?清除能力。分析原因可能是一方面由于不同濃度溶劑的極性不同，另一方面實驗所選青稞的生長環(huán)境及其品種的基因型影響其所含酚類物質(zhì)的含量，進(jìn)而影響其抗氧化活性。因此，不同提取溶劑對青稞中不同酚類物質(zhì)提取效率不同。

可食植物中天然存在的大部分多酚都是以游離或結(jié)合（與多糖或蛋白通過酯鍵和醚鍵）的形式存在[22]，長期以來對谷物酚類化合物的研究多停留在游離酚層面，現(xiàn)在研究通過對谷物樣品進(jìn)行酸解、堿解、酶解等處理，可提取出其結(jié)合型酚類化合物，研究發(fā)現(xiàn)谷物中總酚含量與果蔬相當(dāng)或更高[1,31]，其中堿水解法被廣泛應(yīng)用于水解谷物等材料中的結(jié)合酚[20,32]。然而本研究發(fā)現(xiàn)酸法水解青稞全谷物中結(jié)合酚的總酚、總黃酮含量及抗氧化活性均顯著高于堿法水解物。這與徐菲等[18]報道的酸法更有利于釋放出青稞中的多酚類化合物的結(jié)果相一致。說明酸法相對于堿法具有更強的提取青稞中結(jié)合態(tài)多酚的效果。

3.2 提取溶劑對青稞不同形態(tài)多酚單體組成的影響

不同提取溶劑體系影響青稞全谷物中游離酚及結(jié)合酚的組成與含量。本研究中參試青稞的80%丙酮溶液提取物中檢測到酚類物質(zhì)的組成種類明顯高于其他溶劑體系，且其提取液中總酚類化合物含量也最高，這與Zhao Haifeng等[19]報道的80%丙酮溶液提取的皮大麥中的總酚類物質(zhì)含量最高的結(jié)果相一致，但是報道中只檢測到9 個多酚單體化合物，兒茶素是皮大麥中主要的游離態(tài)多酚物質(zhì)。而本研究在丙酮溶液提取物中檢測到8～18 種多酚單體，明顯高于其報道的皮大麥中的多酚種類及含量，綠原酸與兒茶素是本實驗青稞中游離酚的主要單體物質(zhì)，這與阿魏酸是大麥中主要的多酚物質(zhì)的報道也不同[29]。因此，青稞作為青藏高原的裸大麥，其多酚組成及含量與皮大麥存在顯著的差異。此外，已有報道比較了不同溶劑對荔枝果肉[20]、草莓[33]等提取物游離酚組成的影響，發(fā)現(xiàn)丙酮水提取物中酚類物質(zhì)種類最多，含量也較其他溶劑高。因此，本實驗中80%丙酮溶液是一種高效提取青稞中游離酚類化合物的溶劑。

本實驗中青稞結(jié)合酚酸法提取液中檢測到的單體酚類化合物種類（16～20）及含量明顯高于堿法提取液。沒食子酸、p-香豆酸、丁香酸、苯甲酸、藜蘆酸、橙皮苷是酸法水解青稞的主要結(jié)合酚種類。Nordkvist等[34]報道了大麥中結(jié)合態(tài)多酚主要為阿魏酸與p-香豆酸，而本實驗中阿魏酸在青稞結(jié)合態(tài)提取物中的含量甚微，但同樣含有較高含量的p-香豆酸。這說明p-香豆酸是皮大麥和裸大麥中共同含有的酚酸，而阿魏酸在皮大麥與青稞中含量差異較大。此外，已有報道稱荔枝果肉酸法水解的主要結(jié)合酚是表兒茶素和4-甲基兒茶酚[20]，說明相同方法處理條件下的不同植物來源其結(jié)合酚種類不同。本實驗中酸水解法較堿水解法有利于釋放出更多酚類物質(zhì)，但是酸法水解由于高溫也會損失一些羥基酸[20]。

4 結(jié) 論

提取溶劑的極性對青稞中不同形態(tài)多酚含量和抗氧化活性有顯著影響，且不同品種間存在差異。在4 種不同極性溶劑體系中，80%丙酮溶液提取青稞全谷物中游離態(tài)總酚、總黃酮含量最高，其抗氧化活性最強；酸水解法較堿水解法提取青稞中結(jié)合酚的提取效率高，抗氧化活性好。

不同溶劑對青稞中不同種類單體酚的富集及提取效果不同。80%丙酮溶液提取的青稞游離酚類物質(zhì)種類最多，不同溶劑對青稞中多酚組成的類別具有選擇性；酸法更有利于釋放出更多酚類物質(zhì)，是水解青稞結(jié)合酚的有效方法。

單體酚含量分析發(fā)現(xiàn)，綠原酸、苯甲酸、兒茶素、槲皮素、蘆丁是80%丙酮溶液提取青稞的主要游離態(tài)多酚種類，沒食子酸、p-香豆酸、丁香酸、苯甲酸、藜蘆酸、橙皮苷、丁香酸是酸法水解青稞的主要結(jié)合酚種類。阿魏酸、鄰香豆酸和楊梅素在青稞的游離態(tài)及結(jié)合態(tài)不同溶劑提取物中均具有相對較低的含量。選擇合適的提取溶劑對于評價青稞樣品的多酚含量和抗氧化能力非常重要，該結(jié)果為進(jìn)一步研究青稞全谷物中酚類物質(zhì)提供了一定的理論基礎(chǔ)，對青稞中活性成分的開發(fā)與利用具有參考意義。