黃墨林，張 銳，偉 俊，鄭遠彪，葛建軍

冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass graft，CABG)作為冠狀動脈粥樣硬化型心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)的主要方法，由于取材的限制，大隱靜脈作為橋血管的主要血管使得內(nèi)膜增生成為了靜脈移植后通暢的主要障礙，雖然血管平滑肌細胞的遷移和增殖影響血管重塑過程，但尚未有系統(tǒng)預(yù)防靜脈移植物內(nèi)膜增生的治療方法[1]。平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)的增殖、遷移以及合成分泌大量的細胞外基質(zhì)是內(nèi)膜增生和血管再狹窄的關(guān)鍵[2]，而其中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)信號傳導(dǎo)通路與CABG術(shù)后橋靜脈再狹窄有著密切的關(guān)系。在MAPK家族中，p38 MAPK是較新的一個通路[3]，所以目前已有許多學(xué)者對此問題展開研究并成功建立了大鼠[4]、家兔[5]、狗[6]的頸靜脈移植模型，小型豬的大隱靜脈-頸內(nèi)動脈模型[7-8]。但在臨床實踐中，冠脈的情況較頸動脈仍有差別，分枝更多，血流情況更復(fù)雜，手術(shù)難度更大。但完全模擬人的冠脈搭橋手術(shù)，在不停跳情況下建立豬的冠脈搭橋模型報道較少。有研究[9]表明豬的冠脈解剖更接近于人。所以在小型豬的冠脈搭橋模型上應(yīng)用p38 MAPK通路的高度選擇性抑制劑SB203580(美國Selleck公司)干預(yù)，觀察靜脈橋血管術(shù)后增生以及p38、p-p38的表達情況，對p38 MAPK通路在CABG術(shù)后橋靜脈再狹窄中的作用進行探討，為臨床上進一步防治CABG術(shù)后血管狹窄提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康小型巴馬豬，雌雄不分，體質(zhì)量35～40 kg，由泰州小型豬生產(chǎn)基地提供，術(shù)前正常喂養(yǎng)1周。

1.2主要實驗器械及實驗藥品ZS-MV-HX動物呼吸機(上海恒勤儀器設(shè)備有限公司)；JR2000D心電監(jiān)護儀(山東博科科學(xué)儀器有限公司)；GD350-B電刀(上海瀘通電子有限公司)； 7A-23B負壓吸引器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；BeneHeart D6除顫儀(上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司)；搭橋器械一套(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)；KD-202石蠟切片機(金華科迪儀器設(shè)備有限公司)；舒泰50(WK001，法國virbac公司)；HE染色試劑盒(C0105，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Western blot相關(guān)儀器。

1.3實驗過程動物實驗于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心完成，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準。

1.3.1實驗前準備 正常喂養(yǎng)1周后，術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，稱重，準備手術(shù)臺，準備多巴胺、利多卡因、阿托品等搶救藥品。

1.3.2麻醉 給予舒泰2.5 mg/kg，鹽酸賽拉嗪2 mg/k進行肌注麻醉。麻醉后給予手術(shù)區(qū)域備皮，固定后于耳緣靜脈建立靜脈通道，氣管插管并連接呼吸機，參數(shù)：潮氣量10～12 ml/kg，氧濃度(FiO2)60%～70 %，通氣頻率(f)15～20次/min。并于一側(cè)后腿內(nèi)側(cè)根部切開行股動脈穿刺，檢測動脈血壓及血氧飽和度，實驗組于術(shù)前1 h給予SB203580(3 mg/kg)灌胃，麻醉后在大號喉鏡輔助下插入胃管，深度大約豬身長一半長度，給予配好的溶劑3 mg/kg灌入，為防止返流，灌后應(yīng)抬高豬的上半身1 h后開始手術(shù)。

1.3.3取大隱靜脈 取碘伏消毒胸前及雙側(cè)大腿內(nèi)外側(cè)，鋪巾及無菌洞巾，于右側(cè)后腿背側(cè)關(guān)節(jié)外科行縱行切口，下至后腿第二關(guān)節(jié)，上至大腿根部，長約15～20 cm，組織剪剪開皮下筋膜，鈍性分離脂肪及結(jié)締組織，可見一條暗紫色粗長大隱靜脈，充分游離周圍組織，暴露靜脈，用組織剪剪開血管鞘膜，并用蚊氏鉗鈍性分離；然后用橡皮筋穿過血管下方，輕提血管，由遠心端向近心端緩慢游離靜脈；游離過程中盡量避免破壞血管外膜，用0號絲線或1號絲線結(jié)扎大隱靜脈細小分支，分支結(jié)扎完畢以后，以血管鉗夾閉遠心端，剪斷血管，用小型動物灌胃針插入血管內(nèi)，1號線結(jié)扎固定，近端血管鉗夾閉后剪斷，取下后近端夾閉，遠端從橄欖頭注入肝素水(250 ml生理鹽水加12 500 U肝素)，觀察有無破口，破口處可用6-0prolene或7-0prolene線縫合，待檢查無破口后放入肝素水中備用。

1.3.4搭橋 胸前區(qū)常規(guī)消毒鋪巾，20號刀片沿胸骨中線切開皮膚，電刀逐層切開皮下組織、脂肪、肌肉層，分離并暴露胸骨，胸骨劈刀沿胸骨正中劈開胸骨，電刀止血，胸撐撐開胸骨，分離結(jié)締組織、胸腺組織、充分暴露心包和主動脈；剪開心包并懸吊，在左上肺靜脈上方縫一條紗條，懸吊并充分暴露心臟，側(cè)壁鉗夾閉部分主動脈，待心率血壓穩(wěn)定后用打孔器于夾閉部分打孔，修剪橋靜脈，并用6-0prolene線縫合橋靜脈遠端與主動脈側(cè)孔，夾閉橋靜脈近端，松開側(cè)壁鉗并檢查縫合口有無漏血。暴露冠脈左前降支中遠端，選擇分支較少的一段，以心表固定器固定，有口刀片分離靶血管周圍結(jié)締組織，冠脈刀切開小切口并以前揚剪刀擴大切口，塞入合適分流栓；二氧化碳吹管輔助暴露切口；用6-0prolene或7-0prolene線縫合橋靜脈近端與靶血管；吻合完成后開放血管，檢查吻合口有無漏血、狹窄。以1號絲線結(jié)扎原前降支，待心率，血壓穩(wěn)定后，止血，放入持續(xù)負壓引流管；鋼絲固定胸骨，逐層關(guān)胸。

1.3.5術(shù)中管理 術(shù)中每小時追加一次舒泰(計量為初始計量的1/3)，每小時追加一次肝素(計量為初始計量的1/2)，丙泊酚6～8 ml/h持續(xù)泵入維持麻醉；青霉素60 mg/kg靜滴預(yù)防感染，500 ml生理鹽水+1 g氯化鉀+1.25 g硫酸鎂補充液體和電解質(zhì)。

1.3.6術(shù)后管理 術(shù)后單籠喂養(yǎng)觀察，持續(xù)靜脈補液，每天靜脈給予青霉素(60 mg/kg，分2次，待3 d后恢復(fù)自主進食，精神良好后可返回普通飼養(yǎng)籠。

1.3.7靜脈獲取 術(shù)后喂養(yǎng)4周，常規(guī)麻醉，開胸(操作同前)，分離黏連組織后取血管，觀察通暢情況。用于HE染色者10%的甲醛溶液浸泡固定，24 h后常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)；用于Western blot的部分放入凍存管中-80 ℃保存，提取蛋白，Westem blot法檢測目的蛋白，實驗豬可于心房注射Kcl處死。

1.3.8Western blot檢測p38、p-p38的表達 把取出的血管組織用剪刀盡量剪碎后放入勻漿器中，加入500 U蛋白裂解液，充分碾碎組織，用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中然后在4 ℃下12 000 r/min 離心5 min，取上清液分裝于1 ml EP管中。按照1 ∶4(上樣緩沖液 ∶上清液)的比例加入配制好的上樣緩沖液，放入100 ℃開水中煮30 min，固定蛋白。泠卻后放入-20 ℃冰箱保存。后每組蛋白進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)β-actin蛋白的定量配平后，加入10%的凝膠孔中，依次進行：電泳(濃縮膠60 V，分離膠120 V約2 h)、轉(zhuǎn)膜(300 mA恒流1.5 h)、封閉(5%的脫脂牛奶常溫封閉2 h)、孵育一抗(英國Abcam公司)4 ℃孵育過夜、孵育二抗(英國Abcam公司)常溫搖床孵育2 h、Thermo Scientific SuperSignal West Pico Kit 化學(xué)發(fā)光底物顯影，分析周期蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1各組存活及血管通暢情況假手術(shù)組(n=10)均成活，對照組(n=10)及SB203580組(n=10)各死亡1只，均補做實驗，術(shù)后各組動物傷口均愈合良好，未見感染、出血、傷口裂開等情況。術(shù)后靜脈橋均充盈良好，波動有力，除對照組2只因血栓形成造成橋血管阻塞(以于后期補做)，其余均通暢。

圖1 手中及術(shù)后部分肉眼觀圖片

圖2 HE染色結(jié)果×100

2.2橋血管內(nèi)膜及中膜的病理變化

2.2.1血管肉眼觀情況 大體觀，移植靜脈均有不同程度的擴張、增厚、管壁水腫、管腔狹窄，對照組內(nèi)膜、中膜增厚最為明顯，部分血管可見管腔次全閉塞，壞死物沉積。實驗組也可見管腔內(nèi)增生，但增生程度明顯低于對照組，未見有管腔閉塞。假手術(shù)組增生情況最輕，管腔通暢情況良好，見圖1。

2.2.2HE染色結(jié)果 HE染色后，觀察各組內(nèi)膜、中膜均有不同程度的增生，通過計算機分析顯示：SB203580組與對照組相比，SB203580組內(nèi)膜厚度明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.45，P<0.05)。SB203580組與對照組相比，SB203580組中膜厚度明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.19，P<0.05)。SB203580組與假手術(shù)組相比，SB203580組內(nèi)膜增生厚度高于假手術(shù)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.12，P<0.05)，見圖2、表1。假手術(shù)組僅模擬手術(shù)過程，不進行血管移植；對照組于手術(shù)前進行DMSO灌胃，后進行常規(guī)冠脈搭橋術(shù)；實驗組于術(shù)前1 h給予SB203580 3 mg/kg灌胃。

2.2.3Western bolt結(jié)果 各組血管均以Western bolt檢測p38和p-p38的蛋白產(chǎn)物，測量灰度值后進行統(tǒng)計學(xué)分析，SB203580組與對照組相比，結(jié)果顯示SB203580組的p38和p-p38的產(chǎn)物明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.12，P<0.05)，SB203580組與假手術(shù)組相比，SB203580組的p38和p-p38明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.23，P<0.05)。見圖3。假手術(shù)組僅模擬手術(shù)過程，不進行血管移植；SB203580組于術(shù)前1 h給予SB203580 3 mg/kg灌胃；對照組術(shù)前給以DMSO灌胃，后進行常規(guī)冠脈搭橋手術(shù)。

表1 各組靜脈術(shù)后內(nèi)膜、中膜增生情況比較

與SB203580組比較：*P<0.05 ；與假手術(shù)組比較：#P<0.05

3 討論

CABG術(shù)后靜脈橋再狹窄一直是CABG手術(shù)的一個重要問題，數(shù)據(jù)顯示CABG術(shù)后10年，30%的靜脈橋血管會發(fā)生再狹窄，40%的靜脈橋血管會發(fā)生閉塞[10]。靜脈橋血管再狹窄是一個多因素、長時間、多機制、涉及多個病理變化的過程[11]，目前研究機制表明：內(nèi)皮細胞受損、平滑肌細胞的增殖與遷移、外膜細胞的纖維化、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷以及血流動力學(xué)的改變都會影響到術(shù)后橋血管的再狹窄[12]。其病理過程主要包括：血栓形成、內(nèi)膜增生以及后期的粥樣斑塊硬化。而內(nèi)膜增生是導(dǎo)致前中期血管狹窄的主要因素。其原因主要是在橋血管獲取過程當中由于分離、結(jié)扎、離斷、縫合等操作，以及靜脈動脈化和血流動力學(xué)改變，都會導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷，導(dǎo)致血小板聚集，激活炎癥反應(yīng)，釋放大量細胞因子和炎性介質(zhì)，連同受損內(nèi)皮細胞分泌的一部分有絲分裂因子，促進SMCs的活化，收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，分泌細胞因子和血管活性物質(zhì)，如血小板衍生因子(PDGF)、5-羥色胺(5-HT)、血管緊張素Ⅱ(AT-Ⅱ)、胰島素生長因子等，這些活性物質(zhì)及細胞因子再次促進SMCs大量增殖并向內(nèi)膜遷移，同時產(chǎn)生高于正常水平的細胞外基質(zhì)，引起血管新生內(nèi)膜形成及管壁增厚，管腔狹窄，構(gòu)成了冠脈旁路移植術(shù)后橋血管再狹窄的病理基礎(chǔ)。而后受損的內(nèi)皮細胞與SMCs通過細胞因子的作用形成正反饋循環(huán)。SMCs的遷移、增殖和合成分泌大量的細胞外基質(zhì)是內(nèi)膜增生和血管再狹窄的關(guān)鍵[13]。本研究顯示靜脈移植術(shù)后4周，使用SB203580組的內(nèi)膜增生明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此研究內(nèi)膜增生的變化過程和啟動基因，可以為臨床預(yù)防CABG術(shù)后靜脈橋的狹窄提供新的思路。

圖3 Western bolt結(jié)果

A:各組p38、p-p38表達結(jié)果；B: 各組蛋白測量灰度值比較

另一方面，靜脈管腔較一般冠狀動脈粗，并且與動脈相比缺少具有彈性的肌肉層，當移植到冠狀動脈上時，突然受到高于靜脈壓力約10倍的機械應(yīng)力的刺激，并且在動靜脈吻合口處由于手術(shù)方式和吻合方法的不同，在吻合口處易形成亂流和渦流。研究[14]表明：過高或過低的切應(yīng)力以及異常的振蕩頻率都會引起內(nèi)皮細胞功能的紊亂，內(nèi)膜增生以及血管狹窄往往首先發(fā)生在接口或者發(fā)生機械應(yīng)力改變處。血液中脂質(zhì)、血小板、細小血栓等會持續(xù)沉積于吻合口處，而生物機械應(yīng)力會改變細胞內(nèi)的生理信號傳導(dǎo)及基因表達，促進其分化、增殖和合成基質(zhì)蛋白。橋靜脈在劇增的血管壓力下激活細胞生長所需的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的MAPK。本實驗中SB203580組的p-p38表達明顯受到抑制，低于對照組，且SB203580組的內(nèi)膜、中膜較假手術(shù)組明顯增生，證明靜脈動脈化后P38MAPK通路激活，參與了靜脈內(nèi)膜的增生及血管重塑的過程。

內(nèi)皮的損傷、炎癥反應(yīng)、血流壓力產(chǎn)生的生物機械應(yīng)力的變化，激活血小板及白細胞，并釋放大量炎癥介質(zhì)和細胞因子，連同受損內(nèi)皮細胞分泌的有絲分裂原因子，促進中膜SMCs的活化，使其表型發(fā)生變化，并分泌局部血管活性物質(zhì)和細胞因子，這些活性物質(zhì)再次促進中膜SMCs增殖并穿過血管內(nèi)彈性層向內(nèi)膜遷移，同時產(chǎn)生過量的細胞外基質(zhì)，引起新生內(nèi)膜形成及管壁增厚。受損的內(nèi)皮細胞與SMC通過細胞因子的作用形成正反饋。可能是由于SB203580減輕了p38的磷酸化，抑制了內(nèi)膜和中膜的增厚，減輕了正反饋作用，引起了p38蛋白表達的減少。

本實驗與大鼠、兔、小型豬的頸靜脈-動脈移植相比，手術(shù)過程模擬現(xiàn)在常用的不停跳冠脈搭橋技術(shù)，不論在血管獲取過程、長度、內(nèi)徑、吻合過程以及后期的內(nèi)膜增生過程，都更接近于臨床，證明在冠脈的復(fù)雜血流條件下，p38 MAPK通路對于CABG術(shù)后橋血管的再狹窄起到重要的作用，為進一步預(yù)防CABA術(shù)后血管再狹窄，提高術(shù)后橋血管通暢率提高理論依據(jù)。