顧 曠，周 潔，周 詠，吳 濤，徐孟丹，王默涵，鄭文龍，鄒多宏，王元銀

隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，骨組織工程為骨缺損修復(fù)提供了新的方式，并且引起了廣泛的關(guān)注[1-2]。獲取并培養(yǎng)能在體內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)成骨能力的干細(xì)胞是運(yùn)用骨組織工程修復(fù)骨缺損的主要途徑[3-4]。髂骨來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (iliac bone bone marrow mesenchymal stromal cells，I-BMSC) 具有較強(qiáng)的增殖能力和分化潛能，是目前骨缺損研究中重要干細(xì)胞來源之一[5]。除此以外，來自于牙體組織的干細(xì)胞也表現(xiàn)出與I-BMSC相似的細(xì)胞特性[6-8]。近年來，有研究[9]顯示牙槽骨干細(xì)胞 (alveolar bone-derived stem cells，Al-BMSC) 在成骨誘導(dǎo)后，高表達(dá)成骨相關(guān)基因，為骨組織工程提供一種新的干細(xì)胞來源。Al-BMSC相較于其他牙源性干細(xì)胞具有諸多優(yōu)點(diǎn)，取材方便，容易獲得；位置表淺，取材時(shí)創(chuàng)傷較小等。基于此，該研究創(chuàng)建拉布拉多犬下頜骨種植體近中臨界骨缺損模型，將Al-BMSC和I-BMSC分別與支架材料復(fù)合后，植入種植體近中骨缺損區(qū)，觀察二者的成骨能力差異。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 拉布拉多犬10只，36周齡，體重約1.5 kg，購(gòu)自上海甲干生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑和儀器 高糖DMEM、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；PBS緩沖液(美國(guó)Solarbio公司)；胰蛋白酶、戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司)；β-TCP(上海貝奧路生物材料有限公司)；BLB種植體(北京萊頓生物有限公司)；Bio-Gide(瑞士Geistlich公司)；種植機(jī)(奧地利W&H公司)；CO2恒溫恒濕孵育箱(美國(guó)Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡、倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2方法

1.2.1Al-BMSC和I-BMSC的原代獲取與培養(yǎng) Al-BMSC的培養(yǎng)：使用30 g/L的戊巴比妥溶液靜脈注射麻醉拉布拉多犬6只，麻醉起效后，將拉布拉多犬固定于操作臺(tái)，常規(guī)備皮、消毒，拔除雙側(cè)下頜前磨牙(第一前磨牙、第二前磨牙、第三前磨牙)，從牙槽窩以及其周圍區(qū)域使用咬骨鉗獲取牙槽骨的碎片共約3 g左右，放入含有PBS的離心管中，細(xì)胞房即刻培養(yǎng)。在超凈工作臺(tái)中，使用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗下頜牙槽骨碎片，去除表面口腔唾液的污染。使用無菌器械仔細(xì)去除骨塊外側(cè)的皮質(zhì)骨，只保留含有骨小梁的松質(zhì)骨及包含的血液成分，修剪成2 mm×2 mm大小的碎片，置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2的恒溫恒濕孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。5～7 d后進(jìn)行首次觀察，換液，后每隔3 d細(xì)胞換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。I-BMSC的培養(yǎng)：另取2只拉布拉多犬，靜脈注射麻醉，對(duì)犬的髂骨進(jìn)行常規(guī)備皮消毒鋪巾，使用骨髓穿刺針內(nèi)接含肝素鈉注射液的注射器，進(jìn)行穿刺，抽取骨髓約3 ml注入無菌50 ml離心管，輕輕搖晃均勻，采用全骨髓貼壁法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，5 d后首次換液后每隔3 d細(xì)胞換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)Al-BMSC和I-BMSC細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，使用0.25%胰酶，挑選單個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)行傳代，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2構(gòu)建種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合物 高溫高壓消毒108塊直徑5 mm、厚度2 mm的β-TCP材料，浸泡于不含胎牛血清的DMEM中24 h，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代Al-BMSC與I-BMSC細(xì)胞，稀釋混勻，以1×107個(gè)/ml濃度滴加于β-TCP中，在每片材料滴加100 μl細(xì)胞懸液，每片材料上的細(xì)胞數(shù)：1×107個(gè)/ml×0.1 ml=1×106個(gè)。恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后取部分樣本于電子顯微鏡下觀察材料表面細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3犬下頜骨種植體近中臨界骨缺損模型的建立與修復(fù) 拉布拉多犬前磨牙拔除后3個(gè)月，可以觀察到拔牙區(qū)創(chuàng)口愈合良好，牙槽嵴平坦。使用30 g/L的戊巴比妥溶液靜脈注射麻醉，麻醉起效后，將拉布拉多犬固定于操作臺(tái)，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。使用直徑5 mm的環(huán)鉆在下頜骨缺牙區(qū)制備臨界骨缺損模型(5 mm×5 mm×6 mm，近遠(yuǎn)中徑×頰舌徑×深度)，每個(gè)骨缺損中心間距為12 mm，一側(cè)做3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的骨缺損。在每個(gè)骨缺損區(qū)域的遠(yuǎn)中進(jìn)行種植窩洞的預(yù)備，按種植鉆頭逐級(jí)預(yù)備至3.5 mm，植入3枚BLB親水性種植體，直徑4.1 mm，長(zhǎng)度10 mm，種植體的一側(cè)壁暴露于骨缺損區(qū)。在創(chuàng)建的骨缺損區(qū)，分別植入β-TCP+Al-BMSC復(fù)合物(n=6)，β-TCP+I-BMSC復(fù)合物(n=6)和單純?chǔ)?TCP(n=6)，每個(gè)缺損區(qū)位點(diǎn)放入3塊細(xì)胞材料復(fù)合物 (每個(gè)缺損位點(diǎn)細(xì)胞數(shù)：1×106×3=3×106個(gè))。使用Bio-Gide覆蓋骨缺損區(qū)，間斷縫合創(chuàng)口。術(shù)后，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉注射青霉素(1.5萬IU)2周，每3 d一次。

1.2.4序列熒光標(biāo)記 術(shù)后第4周、第8周、第10周，使用30 g/L的戊巴比妥腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在骨缺損區(qū)域分別注射鹽酸四環(huán)素(TE,25 mg/kg)、鈣黃綠素(CA,20 mg/kg)茜素紅(AL,30 mg/kg)。

1.2.5組織學(xué)分析 術(shù)后第12周，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取拉布拉多犬下頜骨標(biāo)本，置于5%中性福爾馬林溶液中進(jìn)行標(biāo)本固定，梯度脫水，樹脂包埋后，制備硬組織切片。使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)標(biāo)本進(jìn)行熒光標(biāo)記物的觀察。螯合熒光激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為405/560～590 nm (TE,黃), 488/500～550 nm (CA,綠), 和 543/580～670 nm (AL,紅)。利用Image-Pro PlusTM圖像分析軟件分析各組術(shù)后8周、10周和12周的骨礦化情況。將進(jìn)行熒光標(biāo)記物分析的標(biāo)本使用Van Gieson染色劑進(jìn)行染色，檢測(cè)各組骨形成情況。

2 結(jié)果

2.1種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合后的觀察復(fù)合物培養(yǎng)3 d后，取部分樣本，清洗，4%多聚甲醛溶液固定，干燥，于掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，可見Al-BMSC與I-BMSC在支架材料上較均勻分布，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，見圖1。

圖1 掃描電鏡下β-TCP上細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.2序列熒光標(biāo)記物分析激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，β-TCP+I-BMSC組、β-TCP+Al-BMSC 組和單純 β-TCP組的熒光表達(dá)量不同：?jiǎn)渭?β-TCP組TE (黃色) 的表達(dá)量低于β-TCP+I-BMSC組和β-TCP+Al-BMSC 組，CA (綠色) 和AL (紅色) 具有與TE (黃色) 相同的趨勢(shì)，見圖2A。使用Image-Pro PlusTM圖像分析軟件分析熒光表達(dá)面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后顯示：?jiǎn)渭?β-TCP 組TE 的熒光表達(dá)量(1.32%±0.12%) 低于β-TCP+I-BMSC組 (5.12%±0.93%) 和β-TCP+Al-BMSC組 (9.12%±0.21%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，β-TCP+Al-BMSC 組的TE表達(dá)量高于β-TCP+I-BMSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單純?chǔ)?TCP 組CA的熒光表達(dá)量 (2.51%±0.09%) 低于β-TCP+I-BMSC組 (12.52%±0.95%) 和β-TCP+Al-BMSC組 (12.48%±2.42%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，β-TCP+I-BMSC組與β-TCP+Al-BMSC組CA表達(dá)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單純?chǔ)?TCP組AL的熒光表達(dá)量 (1.52%±0.08%) 低于β-TCP+I-BMSC組 (2.52%±0.12%) 和β-TCP+Al-BMSC組 (3.43%±0.13%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，β-TCP+I-BMSC組與β-TCP+Al-BMSC組AL表達(dá)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見圖2B。

圖2 熒光標(biāo)記組織學(xué)分析

A:連續(xù)熒光標(biāo)記后不同時(shí)期熒光表達(dá)：TE (黃色)，CA (綠色)，AL (紅色) ×63；B:各組熒光表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與單純?chǔ)?TCP組比較：*P<0.05；與β-TCP+I-BMSC組比較：#P<0.05

2.3硬組織切片VanGieson染色組織學(xué)分析普通正置顯微鏡下觀察，可見各組骨缺損區(qū)域均有新骨形成。β-TCP組骨缺損處新骨形成較少，種植體表面僅有少量的新生骨結(jié)合。β-TCP+Al-BMSC組與β-TCP+I-BMSC組中，骨缺損區(qū)域有廣泛的新骨形成，且已形成較為成熟的編織骨狀態(tài)，種植體表面有大量的新骨結(jié)合。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，β-TCP+Al-BMSC組新骨形成面積為(21.51%±1.61%)，β-TCP+I-BMSC組新骨面積為(29.82%±3.23%)，β-TCP組的新骨形成面積為(9.93%±2.43%)， β-TCP+Al-BMSC組和β-TCP+I-BMSC組的新骨形成面積均高于β-TCP組的新骨形成面積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而β-TCP+Al-BMSC組與β-TCP+I-BMSC組新骨形成量差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 β-TCP+Al-BMSC組種植體周圍骨結(jié)合率(0.61±0.07)與β-TCP+I-BMSC組種植體周圍骨結(jié)合率 (0.87±0.04)均大于β-TCP組 (0.04±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=394.82，P<0.05)，而β-TCP+I-BMSC組骨結(jié)合率高于β-TCP+Al-BMSC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，見圖3。

3 討論

牙種植體的植入和穩(wěn)定依賴足夠的頜骨骨量支持和有效的種植體骨結(jié)合。因腫瘤、外傷、牙周病等因素導(dǎo)致的上下頜骨骨組織缺損越來越常見，嚴(yán)重影響了牙種植體的有效植入。對(duì)于小范圍的骨缺損，通過同期植入顆粒型小?；|(zhì)骨，結(jié)合骨組織自身的再生能力可在種植體植入的同時(shí)實(shí)現(xiàn)缺損骨修復(fù)。臨界骨缺損，是指無法通過機(jī)體自身再生能力進(jìn)行愈合的缺損，目前廣泛認(rèn)可的動(dòng)物模型中骨缺損的臨界尺寸為直徑5 mm[10]。對(duì)于治療臨界骨缺損以及超過臨界范圍的嚴(yán)重骨缺損，自體骨移植是金標(biāo)準(zhǔn)，但自體骨的獲取常常受到供體區(qū)骨量不足、供區(qū)二次損傷、手術(shù)疼痛增加等限制，因此，骨組織工程為修復(fù)較大骨缺損提供了新的治療方式。

骨組織工程主要包括4個(gè)要素：種子細(xì)胞、生物材料、生長(zhǎng)因子和血管化。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，將種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合后促進(jìn)骨缺損修復(fù)，是骨組織工程學(xué)的熱點(diǎn)之一[4]。而種子細(xì)胞的選擇直接關(guān)系到最終的修復(fù)效果。I-BMSC具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力、優(yōu)秀的分化潛能，是骨組織工程主要的種子細(xì)胞之一。Al-BMSC也具有較強(qiáng)的干細(xì)胞增殖分化能力，且取材方便，在拔牙或牙槽嵴修整手術(shù)同時(shí)即可獲得足夠量的牙槽骨，不會(huì)給患者造成二次創(chuàng)傷。大量研究[11]顯示，I-BMSC與Al-BMSC均有較強(qiáng)的成骨分化能力。Lloyd et al[12]將迷你豬Al-BMSC與脛骨來源的BMSC同時(shí)使用FGF-2進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果顯示Al-BMSC的ALP活性高于脛骨來源的BMSC。Matsubara et al[9]利用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)犬Al-BMSC和I-BMSC后，Al-BMSC 組中ALP的活性與鈣離子的含量均與I-BMSC組相近。Pekovits et al[13]將采集到的人Al-BMSC與I-BMSC使用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2周后，Al-BMSC組與I-BMSC組間BGLAP (骨γ羧基谷氨酸蛋白) 與SPARC (富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白) 基因表達(dá)水平無明顯差異。

圖3 術(shù)后12周Van Gieson染色組織學(xué)分析

A：Van Gieson染色后各組骨形成情況；B:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析新骨形成面積；C:種植體周圍骨結(jié)合率；與單純?chǔ)?TCP組比較：*P<0.05；與β-TCP+Al-BMSC組比較：#P<0.05

與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)[11]顯示，通過成骨誘導(dǎo)液骨向誘導(dǎo)犬Al-BMSC以及I-BMSC，誘導(dǎo)后第7天、第14天以及第21天提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，Al-BMSC組中ALP、COL-I以及OCN的基因表達(dá)略高于I-BMSC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是，Al-BMSC與I-BMSC促進(jìn)體內(nèi)缺損骨再生的能力還未見相關(guān)報(bào)道?；诖?，該研究對(duì)犬Al-BMSC和I-BMSC促進(jìn)種植體近中臨界骨缺損修復(fù)的能力以及與種植體實(shí)現(xiàn)骨結(jié)合的能力進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，犬Al-BMSC與I-BMSC均可促進(jìn)下頜骨種植體近中臨界骨缺損修復(fù)，在新骨形成能力方面，兩者無明顯差別，而I-BMSC可促進(jìn)更多的骨質(zhì)與種植體實(shí)現(xiàn)骨結(jié)合，這種差異可能源自于Al-BMSC的獲取方式與I-BMSC不同。Al-BMSC的獲取主要有兩種方式：骨髓抽吸法和骨塊培養(yǎng)法。骨髓抽吸法：Lloyd et al[12]通過 CT掃描和組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，迷你豬下頜骨正中聯(lián)合處近下頜骨下緣1/3處骨組織中含有豐富的松質(zhì)骨，可使用穿刺針直接抽取獲得下頜骨骨髓血，培養(yǎng)獲得Al-BMSC。 Matsubara et al[9]直接使用穿刺針在比格犬下頜磨牙附近骨組織進(jìn)行穿刺采集下頜骨骨髓血，培養(yǎng)獲得Al-BMSC。骨塊培養(yǎng)法：Pekovits et al[13]和Akintoye et al[14]將采集到的牙槽骨碎片直接培養(yǎng)在含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞爬出增殖后傳代。本課題組在獲取犬原代Al-BMSC時(shí)，通過穿刺幾乎抽取不到拉布拉多犬下頜骨骨髓血，為了獲得犬Al-BMSC，本研究參考骨塊培養(yǎng)法，用咬骨鉗獲取犬下頜骨磨牙處骨質(zhì)，去除密致骨，保留松質(zhì)骨和骨髓血進(jìn)行體外培養(yǎng)，待細(xì)胞爬出結(jié)合挑克隆技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，盡可能保證所獲取細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，但是難免少量牙槽骨成骨細(xì)胞混入，導(dǎo)致骨向分化能力不足，影響其與種植體實(shí)現(xiàn)骨結(jié)合。