●高瑞娜（朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 山西 朔州 030006）

家蠶是一種產(chǎn)絲昆蟲，由于其具有重要的經(jīng)濟價值、詳盡的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究背景，現(xiàn)已成為重要的模式生物[1]。但是，隨著工業(yè)、城市以及農(nóng)業(yè)環(huán)境的污染加劇，如氟化物、工業(yè)粉塵、殺蟲劑及飼料添加劑的濫用等，嚴(yán)重影響了家蠶的正常生長發(fā)育，使絲綢行業(yè)遭到了巨大的威脅。在長期的人工馴化過程中，家蠶的抗逆能力逐漸下降，對外界刺激物的耐受力減弱，因此，提高家蠶的抗逆性和抗病性成為近年來的研究熱點之一。

細(xì)胞色素P450加單氧酶是重要的代謝酶系，不僅涉及一系列的內(nèi)源代謝復(fù)合物如激素、脂肪酸、幽類化合物和維生素等的代謝，也涉及對外源復(fù)合物如藥物、環(huán)境污染物、化學(xué)制品、殺蟲劑以及植物毒素等多種化合物的代謝[2，3]，是昆蟲體內(nèi)三大解毒酶家族之一[4]，對昆蟲抗性起著十分重要的作用，同時對其生長發(fā)育有著非常關(guān)鍵的功能。在基因進(jìn)化過程中，與代謝抗性相關(guān)的基因趨向于和昆蟲特殊的生長環(huán)境及取食習(xí)性相適應(yīng)，而與昆蟲生長發(fā)育相關(guān)的基因功能則相對保守穩(wěn)定[5]。本文以期通過對家蠶在各種外界刺激下的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行綜述，為加強P450基因參與昆蟲反防御機制的研究、推動害蟲治理向分子水平的技術(shù)進(jìn)步提供更科學(xué)合理的理論指導(dǎo)。

1 對植物次生物質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

家蠶主要以桑葉為食料，而桑葉中含有較高的槲皮素、蘆丁、蕓香苷和生物堿等次生物質(zhì)，用來驅(qū)避植食性昆蟲而保全自己，干擾昆蟲的正常生長[6]。Zhang[7]用含0.5%和1%的槲皮素飼料喂食家蠶，用實時熒光定量PCR檢測到中腸組織中CYP6AB5、CYP6B29基因表達(dá)量分別是對照組的10.9倍和6.2倍；同時用槲皮素和蘆丁分別處理整蠶后細(xì)胞色素P450酶活性也顯著上升。本人前期用蕓香苷誘導(dǎo)家蠶，用雙熒光定量PCR也檢測到在中腸和脂肪體中CYP4M5和CYP4M9基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。這些結(jié)果說明細(xì)胞色素P450基因與植物次生物質(zhì)的代謝具有一定的相關(guān)性。

2 對氟化物的誘導(dǎo)表達(dá)

隨著我國工業(yè)化的發(fā)展，大量氟化物被釋放到環(huán)境中，隨桑葉進(jìn)入蠶體累積，與組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制組織細(xì)胞的生長發(fā)育，使蠶體出現(xiàn)氟中毒現(xiàn)象，甚至死亡[8，9]。氟化物污染對蠶業(yè)生產(chǎn)造成的危害和相關(guān)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟損失已引起蠶業(yè)界廣泛關(guān)注。Zhou等[10]用熒光差異顯示技術(shù)對家蠶抗性品系與敏感品系的中腸組織進(jìn)行比較對照分析，結(jié)果在只存在于抗性品系中的一條特異性電泳條帶克隆獲得一個家蠶P450基因CYP306A1，實時熒光定量PCR結(jié)果分析表明該基因在抗性品系中具有較高轉(zhuǎn)錄活性。對該基因的表達(dá)特異性用半定量PCR分析，結(jié)果只在中腸和卵巢兩個組織中表達(dá)。米智等[11]發(fā)現(xiàn)在氟化物誘導(dǎo)后家蠶抗性品系T6中腸組織中的細(xì)胞色素P450含量比對照組高3～7倍，而敏感品系734的變化則不明顯。該酶系中細(xì)胞色素b5含量的變化與其基因表達(dá)具有較高的一致性，表明P450酶的活性也與之相關(guān)。米智[12]還發(fā)現(xiàn)在NaF作用下耐氟抗性品系T6中腸的NADPH一細(xì)胞色素P450還原酶CPR活性變化范圍與對照組相差不大，而敏感品系734的活性變化范圍比對照組顯著上升，由此推測CPR與家蠶對氟化物代謝也具有一定的關(guān)系。本研究室Sisi Zhao[13]在NaF誘導(dǎo)后用雙熒光載體檢測系統(tǒng)檢測到CYP9A19和CYP9A22基因啟動子活性有明顯的劑量效應(yīng)。

3 對殺蟲劑的誘導(dǎo)表達(dá)

人們對昆蟲殺蟲劑抗性研究一般是為了降低昆蟲的抗性，但對家蠶而言則主要是為了提高對殺蟲劑的抵抗力。

Yamamoto等[14]利用二嗪農(nóng)、吡蟲啉、芐氯菊酯等不同種類農(nóng)藥分別對家蠶進(jìn)行添食，微陣列結(jié)果表明二嗪農(nóng)與CYP4M5、CYP4G22(CYP4G25)和CYP333A2(BGIBMGA005356)、吡蟲啉與CYP9A20，CYP4G22和CYP333A2，芐氯菊酯與CYP4G22和CYP333A2之間呈現(xiàn)出誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的關(guān)系，其中CYP4G22可在吡蟲啉、芐氯菊酯誘導(dǎo)下分別上調(diào)表達(dá)8.3倍和8.9倍。李濤[15]用溴蟲腈藥液浸泡桑葉喂食家蠶，發(fā)現(xiàn)同一齡期耐受品系的細(xì)胞色素P450含量高于敏感品系，而且耐受品系的幼蟲隨著發(fā)育齡期對溴蟲腈的耐受性也增加。顧芝亞[16]用辛硫磷添食家蠶，用芯片技術(shù)和熒光定量PCR方法都檢測到CYP4G25和CYP9A21基因在轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。Fanchi Li等[17]在辛硫磷誘導(dǎo)家蠶后用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450基因4家族、6家族、9家族基因在脂肪體中表達(dá)都上調(diào)，用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測到CYP49A1、CYP6AB4、CYP9A19、CYP9A22基因在誘導(dǎo)后持續(xù)高水平表達(dá)。趙國棟等[18]用微量氰戊菊酯添食家蠶，用熒光定量PCR方法檢測到敏感性品系脂肪體組織中CYP9A19和CYP9A20基因的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比顯著下調(diào)，在中腸組織中兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯；而耐受品系的中腸組織中這兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比顯著增加，在脂肪體組織中CYP9A20基因的轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)。這些結(jié)果說明家蠶細(xì)胞色素P450基因家族在殺蟲劑代謝解毒中起一定的作用。

4 對納米二氧化鈦的誘導(dǎo)表達(dá)

納米二氧化鈦的粒徑＜100nm，由于具有抗菌、自潔凈、抗老化及較高的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、超親水性、非遷移性、表面吸附性和光催化活性等特性，被廣泛應(yīng)用于漂白、食品添加劑、遮光劑和化妝品等領(lǐng)域。低濃度的納米二氧化鈦對核酸的合成不會造成影響，但高濃度的納米二氧化鈦對生物則具有一定的毒性作用[19，20]。由于納米二氧化鈦具有一定的生物活性，已被農(nóng)業(yè)部列入飼料添加劑品種目錄[21]。占鵬飛等人[22]用低濃度納米二氧化鈦浸泡桑葉后喂食5齡起蠶，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450氧化酶活性顯著上升，用實時熒光定量PCR檢測到BmCYP6ae22基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平有差異，在脂肪體中最多，是對照組的3.438倍，中腸次之，是對照組的2.24倍，與其酶活性的變化趨勢一致。說明低濃度納米二氧化鈦可以誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞色素P450基因表達(dá)上調(diào)，解毒酶活性上升，提高對進(jìn)入體內(nèi)有毒物質(zhì)的降解能力。

5 總結(jié)與展望

昆蟲在與植物的協(xié)同進(jìn)化中，可以改變其取食策略或調(diào)節(jié)生長發(fā)育節(jié)律對植物的防御進(jìn)行抵抗，同時又能降低靶標(biāo)物對有毒物質(zhì)的敏感性，增加解毒酶活性來主動降解植物產(chǎn)生的有毒物質(zhì)進(jìn)行反防御[23]。昆蟲P450基因不僅能直接參與植物次生有毒物質(zhì)的代謝降解，而且已有研究表明還可以通過竊聽植物的分子信號來活化自身解毒酶活性[24]。唐濤等[25]通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AhR信號通路可能參與P450解毒酶基因的表達(dá)調(diào)控，而且通過遺傳分析，棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄因子AhR和ARNT基因與家蠶同源性最高，為進(jìn)一步調(diào)控機制研究奠定分子基礎(chǔ)。

鱗翅目有多種昆蟲，是昆蟲綱中第二大目，又是主要的農(nóng)業(yè)與森林害蟲，而家蠶作為重要的經(jīng)濟昆蟲和實驗動物，是第一個完成了全基因組測序的鱗翅目昆蟲，其基因組中P450基因已經(jīng)得到序列分析與功能的初步預(yù)測。而且研究發(fā)現(xiàn)家蠶84個P450基因中主要與代謝抗性相關(guān)的基因產(chǎn)生大量的串聯(lián)復(fù)制，數(shù)量眾多，且相互之間存在一定的底物相似性、重疊性，在功能上表現(xiàn)出一定程度的冗余，使其在應(yīng)對外界抗性時具有較強的彈性[26]，因此，利用微陣列、熒光定量PCR、基因芯片及RNA干擾技術(shù)等基因組學(xué)研究技術(shù)對P450基因家族進(jìn)行功能驗證、參與反防御機制的深入研究，可以為害蟲治理提供可靠的靶標(biāo)位點，推動害蟲治理向分子水平進(jìn)步。