馬騰臻，魯榕榕，孫永蓉，溫 靖，李夢捷，楊學(xué)山，韓舜愈

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅蘭州 730070）

瓶內(nèi)二次發(fā)酵是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)起泡葡萄酒的傳統(tǒng)方法，然而接種時較低的發(fā)酵溫度、碳源和可同化氮源含量，較高的酒精度、總酸和游離SO2含量，以及發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的CO2壓力和一些有毒副產(chǎn)物（如C6-C12中鏈脂肪酸和有機酸）等嚴(yán)重影響了起泡葡萄酒的二次啟酵及發(fā)酵進程[1-2]。

適應(yīng)活化是指酵母菌對一個或多個抑制因子幾小時或幾天的適應(yīng)過程[3]。此過程中，酵母激活了與高酒精濃度及其他抑制條件相關(guān)的新陳代謝應(yīng)激反應(yīng)，并在較大程度上減弱了抑制因子對酵母細(xì)胞的影響[4-5]。研究表明，酵母復(fù)水活化過程中稀釋倍數(shù)、活化液含糖量、活化溫度和時間[6-8]等對提高酵母菌活性具有重要作用。為避免釀造過程中酵母細(xì)胞大量死亡而導(dǎo)致的發(fā)酵提前終止，釀酒師們往往在接種前用酒水混合液對商品活性干酵母進行適應(yīng)性活化處理，近年來商品氮源和酵母活化劑等在釀酒工業(yè)中日也益受到重視[9-10]。

碳源是酵母生長及維持生命活動的最基本物質(zhì)，發(fā)酵液中的糖含量能夠改變酵母細(xì)胞在適應(yīng)活化階段的生長及代謝過程，從而影響后續(xù)發(fā)酵進程[11]。氮源是酵母生長代謝所需的重要營養(yǎng)元素，活化基質(zhì)中氮源的類型（有機氮或無機氮）及含量能夠提高酵母菌生物量、細(xì)胞活力及其在嚴(yán)苛環(huán)境下的生長生存能力[12]，從而影響二次發(fā)酵過程和產(chǎn)品品質(zhì)[13]。

適應(yīng)活化過程中，氧氣可參與酵母細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸和甾醇類物質(zhì)的合成，從而提高酵母生物量及其乙醇耐受性，從而促進二次發(fā)酵[14-15]。研究表明，少量通氣可使酒精發(fā)酵過程中酵母活細(xì)胞數(shù)增加[16]，但過多氧氣的存在則可能導(dǎo)致酵母細(xì)胞中活性氧（ROS）的積累[17]。

由于起泡葡萄酒的二次發(fā)酵需在原酒中進行，因此對起泡葡萄酒酵母發(fā)酵性能進行評價時，除考慮釀造靜止葡萄酒時的起酵速度、發(fā)酵活力、酒精耐受性、抗二氧化硫能力和不良風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生等指標(biāo)外，還需考慮其自溶能力、產(chǎn)氣能力、耐壓能力、低溫發(fā)酵能力等特殊指標(biāo)[18-19]。

試驗以常用于起泡葡萄酒釀造的EC1118酵母為材料，研究了適應(yīng)活化過程中不同碳源、氮源含量和通氧條件對模擬葡萄酒發(fā)酵過程中酵母生物量、產(chǎn)氣能力、自溶性、絮凝性和耐受性的影響，以期為瓶內(nèi)二次發(fā)酵過程中酵母菌的適應(yīng)性活化及起泡葡萄酒的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

釀酒酵母EC1118，法國Lallemand公司提供；牛血清蛋白，SIGMA-ALDRICH（上海）貿(mào)易有限公司提供；考馬斯亮藍、蔗糖、磷酸氫二銨、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、甘油、醋酸鈉、氫氧化鉀、乙醇、偏重亞硫酸鈉等試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供。

1.2 儀器設(shè)備

Genesis 10s型紫外-可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；10713型起泡酒壓力測定儀，意大利ZAMBELLI公司產(chǎn)品；SPX-300-II型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；CP 214型電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；18100型摩爾超純水機，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司產(chǎn)品；EX31型生物顯微鏡，舜宇光學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；NRY-2102型恒溫空氣搖床，上海南榮實驗室設(shè)備有限公司產(chǎn)品；H2050R型臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母活化

（1） 適應(yīng)活化[20]。①復(fù)水。按推薦用量將酵母EC1118用10倍體積的蒸餾水（38℃）活化30 min；②擴培。將步驟①所得菌懸液接入模擬酒中擴培24 h（25℃，150 r/min）。模擬酒配方。蔗糖質(zhì)量濃度45 g/L，酒石酸質(zhì)量濃度4 g/L，檸檬酸質(zhì)量濃度0.5 g/L，蘋果酸質(zhì)量濃度1.5 g/L，磷酸氫二銨質(zhì)量濃度100 mg/L，甘油質(zhì)量濃度4 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)8%（V/V），醋酸鈉質(zhì)量濃度0.134 g/L，并用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值為3.1。③適應(yīng)性活化。將步驟②所得菌懸液接入乙醇含量為10%的模擬酒中培養(yǎng)48 h（模擬酒碳源、氮源含量及通氧條件如表1所示）。

（2）普通活化。將復(fù)水活化的酵母菌懸液接入乙醇含量為10%的模擬酒中繼續(xù)活化30 min，記為對照（CK） 組。

適應(yīng)活化時的培養(yǎng)條件見表1。

表1 適應(yīng)活化時的培養(yǎng)條件

1.3.2 生物量測定

用血球計數(shù)法對酵母菌細(xì)胞計數(shù)，每個樣品重復(fù)測定3次，并按公式（1） 計算[21]：

酵母細(xì)胞數(shù)=

1.3.3 酵母發(fā)酵特性測定

（1）模擬酒配方。調(diào)整蔗糖含量為20 g/L，不添加乙醇和磷酸氫二銨，其余成分同1.3.1中擴培階段模擬酒。

（2） 產(chǎn)氣能力。按5×106CFU/mL接種量向裝有模擬酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%（V/V））的艾氏發(fā)酵管中接種經(jīng)不同方式活化的酵母菌，于28℃下靜置培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)氣量（mL）[18]。

（3）酵母的自溶性。參照王玉霞方法，以活化上清液中的蛋白質(zhì)含量評價酵母自溶性[18]。

蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

（4） 酵母的絮凝性。取2 mL酵母活化培養(yǎng)液，蒸餾水稀釋10倍，充分搖勻后于波長620 nm處測定吸光度并記為N1，靜置30 min后測定吸光度并記為N2，絮凝系數(shù)為N2/N1[18]。

（5）乙醇耐受性。調(diào)整模擬酒中的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%，11%，12%（V/V），接種酵母并于28℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)氣體積[18]。

（6） SO2耐受性。調(diào)整模擬酒中的SO2質(zhì)量濃度分別為50，75，100 mg/L，接種酵母并于28℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)氣體積[18]。

（7） 高酸耐受性。配置pH值為3.0，3.2，3.5的模擬酒，接種酵母并于28℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)氣體積[18]。

（8） 低溫耐受性。向乙醇體積分?jǐn)?shù)10%（V/V），pH值3.1，SO250 mg/L的模擬酒中接種酵母，于12，16℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，記錄產(chǎn)氣體積[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS Statistics 19.0進行試驗數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（Duncan法，多因素方差分析，p＜0.05）。

發(fā)酵特性標(biāo)準(zhǔn)化處理[1]：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同適應(yīng)活化條件對酵母菌生物量的影響

不同適應(yīng)活化條件下酵母菌生物量見圖2。

圖2 不同適應(yīng)活化條件下酵母菌生物量

由圖2可知，酵母生物量受氧氣條件、碳源和氮源含量的綜合影響，經(jīng)適應(yīng)活化方式培養(yǎng)的酵母菌生物量高于普通活化方式所得酵母，尤其是有氧條件處理組，生物量差異更為顯著（p＜0.05），且高于厭氧條件處理組，這可能與酵母細(xì)胞進行有氧呼吸代謝，處于生長增殖狀態(tài)有關(guān)。就碳源含量而言，中等質(zhì)量濃度條件（22 g/L）活化處理所得酵母菌的生物量較高；就氮源含量而言，厭氧條件活化時隨氮源含量的升高，酵母菌生物量也隨之增大，而有氧條件時則呈先增大后降低的趨勢，這可能與活化培養(yǎng)基碳氮比及通氧條件共同作用有關(guān)。

2.2 不同適應(yīng)活化條件對酵母菌產(chǎn)氣能力的影響

不同適應(yīng)活化條件下酵母菌產(chǎn)氣能力見圖3。

由圖3可知，不同適應(yīng)活化條件對酵母菌產(chǎn)氣能力有較大影響，隨活化基質(zhì)中碳源和氮源含量的增加，酵母菌的產(chǎn)氣量基本呈上升趨勢。盡管有氧呼吸時CO2的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于厭氧條件下，但厭氧條件活化所得酵母菌在隨后的發(fā)酵試驗中展現(xiàn)了遠(yuǎn)高于有氧條件活化菌株的產(chǎn)氣能力，這可能是由于厭氧條件下，某些參與TCA循環(huán)的酶仍然保持活性，這些額外的代謝途徑能夠合成細(xì)胞功能所需的重要前體物質(zhì)，并決定最終產(chǎn)氣體積[22]。

圖3 不同適應(yīng)活化條件下酵母菌產(chǎn)氣能力

2.3 不同適應(yīng)活化條件對酵母菌絮凝性的影響

不同適應(yīng)活化條件下酵母菌絮凝指數(shù)見圖4。

圖4 不同適應(yīng)活化條件下酵母菌絮凝指數(shù)

由圖4可知，厭氧條件活化所得酵母菌株的絮凝性明顯優(yōu)于有氧條件活化所得菌株，且差異顯著（p＜0.05），而與普通活化處理相比差異不顯著。有氧條件活化所得酵母菌株的絮凝性隨碳源含量的增高而增大（N3除外），但氮源含量的改變對所得菌株的絮凝性影響不顯著。此外，當(dāng)活化培養(yǎng)基中氮源含量較低時（50 mg/L），不同通氧條件所對應(yīng)的酵母絮凝指數(shù)隨碳源含量的增大呈相反變化趨勢，這可能與活化時的不同呼吸方式有關(guān)。

2.4 不同適應(yīng)活化條件對酵母菌自溶性的影響

不同適應(yīng)活化條件下酵母菌自溶性評價見圖5。

圖5 不同適應(yīng)活化條件下酵母菌自溶性評價

由圖5可知，厭氧條件活化所得酵母菌株的自溶性比有氧條件活化所得菌株較高，但與普通活化處理相比，除NOS3N2和NOS2N3外，其余處理組差異不顯著。酵母自溶過程中釋放的甘露糖蛋白等膠體類物質(zhì)，可提高酒樣中蛋白質(zhì)和酒石酸的穩(wěn)定性，并與芳香化合物相互作用，提升葡萄酒酒體的飽滿度。選擇蛋白質(zhì)合成能力強，發(fā)酵結(jié)束后能迅速自溶的酵母菌對提升起泡葡萄酒品質(zhì)具有重要作用[22]。

2.5 不同適應(yīng)活化條件對酵母菌高酸耐受性的影響

二次發(fā)酵時，較低的發(fā)酵溫度，基酒中較高的初始乙醇體積分?jǐn)?shù)、總酸及游離SO2含量等限制性因素均會抑制酵母菌的生長繁殖和發(fā)酵進程[19]。適應(yīng)活化過程中，通氧條件及培養(yǎng)液中的碳源和氮源含量可使酵母菌完成從生殖生長到發(fā)酵代謝過程的轉(zhuǎn)化[11-12]，提升其對抗性環(huán)境的耐受性，是促進二次發(fā)酵順利完成的重要輔助措施。

不同適應(yīng)活化條件下酵母菌的高酸耐受性見圖6。

圖6 不同適應(yīng)活化條件下酵母菌的高酸耐受性

由圖6可知，厭氧環(huán)境活化所得酵母菌在不同pH值模擬葡萄酒中的產(chǎn)氣量顯著高于有氧條件活化和普通活化組所得酵母（pH值3.0時NOS1處理組除外），從總體趨勢上看，隨活化培養(yǎng)基中碳源和氮源含量的升高，酵母菌在模擬葡萄酒發(fā)酵時的產(chǎn)氣量也隨之升高，但較低pH值條件下的產(chǎn)氣量高于中等pH值條件（白葡萄酒中pH值3.0和pH值3.2屬于較低條件，pH值3.5則屬于中等條件）。葡萄汁和葡萄酒中的pH值對酵母菌的生長至關(guān)重要，不僅決定其生長及發(fā)酵速率，對具有感官特征的重要代謝產(chǎn)物也有影響[22]。盡管釀酒酵母的生長速率和發(fā)酵速率隨會pH值降低而減緩，但對于適應(yīng)活化后的酵母，其在pH值3.5的模擬酒中可能更多地進行了生殖生長，而在較低pH值條件下則主要進行酒精發(fā)酵，因此導(dǎo)致了產(chǎn)氣量的不同，但還需進一步測定發(fā)酵后的生物量進行確認(rèn)。

2.6 不同適應(yīng)活化條件對酵母菌的乙醇耐受性影響

研究表明，酵母菌通過膜通透性的破壞和流動性的變化實現(xiàn)對乙醇毒性的適應(yīng)性響應(yīng)，膜的完整性依賴于存活因子（甾醇和長鏈不飽和脂肪酸）的補充，含有高濃度存活因子的酵母細(xì)胞具有很強的迅速完成發(fā)酵的能力，這也是適應(yīng)性活化的主要作用[11]。

不同適應(yīng)活化條件下酵母菌的乙醇耐受性見圖7。

圖7 不同適應(yīng)活化條件下酵母菌的乙醇耐受性

由圖7可知，隨模擬葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，酵母細(xì)胞通過補充細(xì)胞膜上的存活因子進行響應(yīng)，這種補充在一定程度上抵消了乙醇的破壞作用，部分恢復(fù)了細(xì)胞膜原有的通透性和流動性，但發(fā)酵過程中的二氧化碳產(chǎn)量依然呈降低趨勢。盡管普通活化處理所得菌株對乙醇的耐受力優(yōu)于大多數(shù)適應(yīng)活化處理所得酵母，但隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加（從10%～12%），NOS2，NOS3和OS3適應(yīng)活化處理酵母也逐漸顯露出其對乙醇體積分?jǐn)?shù)的耐受能力。此外，隨活化培養(yǎng)基中碳源含量（僅在厭氧環(huán)境條件下）和氮源含量的增加，酵母對乙醇的耐受性增強，尤其是厭氧活化處理組更為明顯。

DAMORE等學(xué)者也指出，細(xì)胞膜流動性的變化是決定酵母細(xì)胞耐受性的主要因素，氧氣在甾醇和長鏈不飽和脂肪酸等物質(zhì)的合成中具有重要作用，是影響酵母菌乙醇耐受性的主要因素，同時酵母菌對高溫和高酒精度的耐受性相似，可通過應(yīng)激反應(yīng)減少對細(xì)胞活性的影響。

2.7 不同適應(yīng)活化條件對酵母菌的SO2耐受性影響

不同適應(yīng)活化條件下酵母菌的SO2耐受性見圖8。

圖8 不同適應(yīng)活化條件下酵母菌的SO2耐受性

由圖8可知，酵母菌在模擬酒中的產(chǎn)氣量隨SO2質(zhì)量濃度升高而降低，其中有氧環(huán)境活化所得酵母對SO2的耐受性顯著高于厭氧環(huán)境活化所得酵母，但后者與普通方式活化所得酵母相比差異不顯著。此外，有氧條件時，隨活化培養(yǎng)液中碳源含量和氮源含量的增加，活化酵母菌對SO2的耐受性也隨之提高，部分處理組差異顯著。

研究表明，酵母可利用SO2或SO42-等硫元素合成含硫氨基酸和其他代謝產(chǎn)物，但分子態(tài)SO2則又通過多種形式抑制微生物的生長，如提高胞內(nèi)濃度，使蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂或與NAD+和FAD中的輔因子起反應(yīng)等[22]。此外，抑制酵母菌生長所需的分子態(tài)SO2質(zhì)量濃度受葡萄酒pH值、溫度、微生物數(shù)量與種類、生長期、酒精度等因素的共同影響，最適含量還需進一步確定。

2.8 不同適應(yīng)活化條件對酵母低溫耐受性的影響

不同活化條件下酵母菌低溫耐受性見圖9。

圖9 不同活化條件下酵母菌低溫耐受性

對于起泡葡萄酒而言，為保留更多的香氣和CO2，常選擇在較低的溫度下進行二次發(fā)酵。如圖9所示，與普通活化方式相比，適應(yīng)活化顯著提升了發(fā)酵過程中酵母菌對低溫的耐受能力（OS1處理組除外），厭氧環(huán)境活化所得酵母菌在隨后發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣量高于有氧環(huán)境活化所得酵母菌，且差異顯著，此外產(chǎn)氣量也隨活化培養(yǎng)基中碳源和氮源含量的升高而升高。

2.9 酵母菌最佳活化條件的確定

考慮到活化過程所涉及的指標(biāo)變化及對酵母菌發(fā)酵性能的評價參數(shù)較多，很難確定較佳的適應(yīng)活化條件，對相關(guān)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理是解決該難題的有效方法（計算方法見1.4）。

不同活化條件下酵母菌發(fā)酵特性O(shè)I總值見表2。

表2 不同活化條件下酵母菌發(fā)酵特性O(shè)I總值

表2為不同活化條件下酵母菌發(fā)酵特性標(biāo)準(zhǔn)化處理值之和（即OI總值），大多高于普通活化所得OI總值（5.82），表明發(fā)酵前適應(yīng)活化處理可提高釀酒酵母菌的發(fā)酵特性。

衡量酵母菌發(fā)酵特性的OI總值隨活化培養(yǎng)基中碳源和氮源含量的升高而升高，且在不同通氧活化條件下表現(xiàn)出不同的發(fā)酵特性，這可能是由于對相近環(huán)境的更快適應(yīng)所致，NOS3N2處理條件活化所得酵母的OI值最高，最適合于起泡葡萄酒的二次發(fā)酵，即酵母EC1118的最佳適應(yīng)活化條件為厭氧培養(yǎng)，活化培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L、磷酸氫二銨質(zhì)量濃度100 mg/L。

3 結(jié)論

（1） 有氧條件下酵母菌的生物量和對SO2的耐受性較好，厭氧條件下酵母的產(chǎn)氣量、絮凝性和自溶性較高，且對高酸和低溫的耐受性較好。此外，通氧條件對酒精度耐受性的影響無明顯規(guī)律。

（2） 隨活化基質(zhì)中碳源含量的升高（15～30 g/L），酵母菌的產(chǎn)氣能力，對低pH值、高SO2、低溫的耐受性，以及有氧條件下絮凝性和厭氧條件下的乙醇耐受性升高；生物量、有氧條件下乙醇耐受性則呈先上升后下降趨勢，蔗糖質(zhì)量濃度為22 g/L時最大。

（3）隨著活化基質(zhì)中氮源含量的升高（50～150mg/L），酵母菌的產(chǎn)氣能力、生物量（厭氧條件），對低pH值、高SO2、低溫的耐受性升高；乙醇耐受性、生物量（有氧條件）呈先上升后下降趨勢，磷酸氫二銨質(zhì)量濃度為100 mg/L時最高；此外，含氮量的改變對于酵母的絮凝性和自溶性無明顯影響。

（4）乙醇適應(yīng)活化處理優(yōu)于傳統(tǒng)活化方法，有助于提升酵母菌二次發(fā)酵活性；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)確定EC1118酵母的最佳活化條件為厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)液中碳源和氮源含量分別為蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L，磷酸氫二銨質(zhì)量濃度100 mg/L。