劉鑫， 楊達勝

過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura，HSP)是一種常見的系統(tǒng)性小血管炎癥性疾病，其病理特點是IgA介導的全身小血管炎癥性損傷，HSP累及腎臟造成腎臟損傷被稱為紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN)。腎累及是影響HSP兒童長期預后的關鍵因素。確診HSP腎損傷最可靠的證據(jù)是腎活檢，但因小兒腎活檢具有侵襲性，可能導致泌尿系統(tǒng)出血性損傷，風險較大，多數(shù)患兒及其家屬難以接受。現(xiàn)臨床上應用的腎損傷指標如血漿肌酐、血漿尿素氮、尿量、胱抑素C及β2-微球蛋白都在一定程度上存在一些局限性，影響預測早期腎損傷的發(fā)生，所以仍需尋找、研究新的生物標記物來更好的對腎損傷的早期做出預測，從而早發(fā)現(xiàn)、早治療，達到良好的預后。

正五聚蛋白是一種多功能的保守蛋白，五聚素3屬于長鏈正五聚蛋白，除炎性細胞因子外，Toll樣受體激動劑，如脂多糖、外膜蛋白A和完整的微生物，都能快速誘導多種細胞類型的五聚素3表達，包括髓樣樹突狀細胞、腎上皮細胞、系膜細胞和顆粒細胞等。有研究表明，在IgA腎病患者的腎活檢中，在擴張的系膜區(qū)域的腎小球系膜和內(nèi)皮細胞中觀察到五聚素3的強烈染色。與這些發(fā)現(xiàn)相反，腎小球腎病患者的正常腎組織和活檢對五聚素3表達主要為陰性[1]。在IgA腎病中，五聚素3通過誘導繼發(fā)性介質(zhì)(例如血小板激活因子)的產(chǎn)生，參與到血管內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮細胞的活化中，這一機制可能導致腎小球和腎小管間質(zhì)損傷。在腫瘤壞死因子α和IgA刺激下，體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞合成五聚素3，并表現(xiàn)出重組五聚素3的特異性結(jié)合[2]。五聚素3誘導的系膜細胞的細胞形態(tài)(細胞收縮)的形態(tài)學改變與腎小球濾過面積和濾過系數(shù)的減少有關。由于五聚素3與IgA腎病的發(fā)生和發(fā)展有關，所以推測五聚素3也有可能與HSPN存在或多或少的相關性，然而關于五聚素3在HSPN中的研究很少。本研究通過對50例HSP患兒及20例正常兒童檢測其血漿及尿液中五聚素3的表達水平，探討其在HSP中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月至2017年9月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科收治的HSP患兒50例，根據(jù)有無累及腎臟分為HSP組32例和HSPN組18例。HSP組中男18例，女14例；年齡4～12歲，平均年齡(7.09±2.70)歲。HSPN組中男8例，女10例；年齡3～10歲，平均年齡(6.89±2.21)歲。同期選取門診健康體檢的20例正常兒童作為對照組，其中男9例，女11例；年齡4～10歲，平均年齡(7.25±1.91)歲。3組研究對象在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照2013年中華醫(yī)學會兒科學分會免疫學組制定的《兒童過敏性紫癜循證診治建議》中的HSP的診斷標準[3]。參照2016年由中華醫(yī)學會兒科分會腎臟病學組制定的《紫癜性腎炎診治循證指南》中HSPN的診斷標準[4]。

1.3 納入標準 (1)符合HSP和HSPN的診斷標準；(2)年齡3～12歲；(3)本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(批準編號：2016090)，患兒家屬知情同意。

1.4 排除標準 (1)IgA腎?。?2)血小板減少性紫癜；(3)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、冷球蛋白血癥等繼發(fā)性小血管炎；(4)肝炎、結(jié)核等造成的血尿和(或)蛋白尿；(5)合并感染的HSP；(6)隨訪6個月，血尿/蛋白尿持續(xù)不轉(zhuǎn)陰的HSP；(7)臨床資料不全者。

1.5 研究方法

1.5.1 標本的采集及處理 所有受試者入院次日或體檢當日清晨取外周靜脈血2 mL及晨起清潔中段尿液，待受試者達到恢復期時再次采集受試者空腹時靜脈血2 mL及清晨清潔中段尿液，靜脈血樣本應用乙二胺四乙酸抗凝管收集，尿液樣本應用無菌管收集，所有樣本均在離心機以2 000 r/min離心20 min，收集上清，并儲存于-80 ℃冰箱凍存以待檢驗。血漿及尿液五聚素3濃度測定均采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，實驗室流程及具體試驗方法均按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 結(jié)果計算 以標準物的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，計算出標準曲線的多項式二次回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.6 觀察指標 各組血漿和尿液中五聚素3表達水平；HSP組和HSPN組患兒急性期、恢復期血漿、尿液五聚素3表達水平。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿和尿液中五聚素3表達水平比較 見表1。

表1 各組血漿、尿液中五聚素3表達水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與HSP組比較，bP<0.05。

表1結(jié)果表明，HSP組和HSPN組血漿和尿液中五聚素3的表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HSPN組血漿和尿液中五聚素3的表達水平顯著高于HSP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 HSP組和HSPN組患兒急性期、恢復期血漿、尿液五聚素3表達水平比較 見表2。

表2 HSP組和HSPN組患兒急性期、恢復期血漿、尿液五聚素3表達水平比較

注：與急性期比較，at=3.708，3.327，12.546，9.364，P<0.05。

表2結(jié)果表明，HSP組和HSPN組恢復期血漿和尿液中五聚素3的表達水平顯著低于急性期，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

HSP是兒科常見的全身性免疫性小血管炎癥性疾病，其致病因素眾多，其中感染因素(如細菌、病毒、支原體、寄生蟲等)最為常見，其次食物及藥物因素、遺傳因素及疫苗接種因素等。本病發(fā)病機制尚未完全闡明，但一般認為主要涉及遺傳學背景及感染或過敏后機體免疫紊亂(IgA、補體系統(tǒng)相關體液免疫紊亂、T淋巴細胞異常相關的細胞免疫等)[5-6]、炎性細胞和炎性細胞因子的作用、凝血和纖溶機制的參與等幾個方面。影響HSP兒童長期預后的關鍵因素在于有無存在腎臟損害，在疾病早期發(fā)現(xiàn)腎臟損害，并予以相應的治療對HSP患兒的預后有很大的干預作用，現(xiàn)階段的腎損傷標志(血漿肌酐、血漿尿素氮、尿量、胱抑素C及β2-微球蛋白等)都有一定程度的局限性，因此尋找、研究新的生物標記物來更好的對腎損傷的早期做出預測至關重要。

正五聚蛋白是一種具體多種生物活性功能的保守蛋白。主要依據(jù)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的差別分類。經(jīng)典的短正五聚蛋白包括C反應蛋白和血漿淀粉樣蛋白P，主要在白細胞介素6的刺激下由肝臟合成。而五聚素3是由炎性細胞因子(除了白細胞介素6)、Toll樣受體激動劑，誘導多種細胞類型產(chǎn)生的一種長鏈正五聚蛋白[7-8]。白細胞介素6不能誘導活性細胞內(nèi)五聚素3的合成，從而強調(diào)了長鏈正五聚蛋白全身性活動性與短鏈正五聚蛋白不同[9]。人的五聚素3基因位于染色體3(q24-28)的長臂上，包含3個外顯子編碼，分別用于領導肽、n-端域和五聚素3蛋白(相對分子質(zhì)量40 165)的c-末端正五聚蛋白相似域[10]。五聚素3與眾多免疫系統(tǒng)相關性疾病有著密切的關系，各系統(tǒng)免疫相關性疾病中都可以發(fā)現(xiàn)五聚素3的高表達[11]。最近的研究表明，PTX3可能具有作為臨床腎臟學的治療靶點的潛力。與健康的人腎臟相比，五聚素3在髓質(zhì)外的腎小管周圍內(nèi)皮細胞上幾乎完全表達[12]，免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，在系膜區(qū)內(nèi)炎性細胞浸潤腎小球、間質(zhì)和腹膜毛細血管均有五聚素3的表達。臨床研究顯示在Ⅱ型糖尿病腎臟病患者中血漿五聚素3濃度水平升高，糖尿病腎臟病伴有微量白蛋白尿時血五聚素3濃度即明顯升高，隨著蛋白尿的增多，血五聚素3濃度進一步升高[13]。在缺血-再灌注損傷小鼠模型中腎臟內(nèi)皮細胞[14]、Ⅰ型膜性增生性腎小球腎炎患者的腎小球系膜和內(nèi)皮細胞都發(fā)現(xiàn)五聚素3表達增加。有研究表明，在IgA腎病患者的腎活檢中，在擴張系膜區(qū)域的腎小球系膜和內(nèi)皮細胞中觀察到五聚素3的強烈染色，而在正常腎組織和活檢對五聚素3表達主要為陰性[1]。在IgA腎病中，五聚素3通過誘導繼發(fā)性介質(zhì)(例如血小板激活因子)的產(chǎn)生，參與到血管內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮細胞的活化中，這一機制可能導致腎小球和腎小管間質(zhì)損傷。由五聚素3與IgA腎病有關，可推測五聚素3在HPS，尤其是HSPN中可能也發(fā)揮著一定的生物功能。

本研究采用ELISA法檢測HSP及過敏性HSPN患兒血漿及尿液中五聚素3的表達水平，通過比較恢復期與急性期血漿及尿液中五聚素3的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)有效治療后，血漿及尿液中五聚素3表達水平較治療前顯著降低，提示五聚素3表達水平的檢測可以反映HSP疾病的活動狀態(tài)，與多項相關性研究結(jié)果一致[1，15-19]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，HSP患兒血漿及尿液中五聚素3的表達水平比正常兒童血漿及尿液中五聚素3的表達水平明顯升高，尤其以HSPN患兒更為顯著，提示五聚素3可能成為HSP患兒腎損傷的一項新的檢測指標，與Ge等[20]的研究結(jié)果一致，并且他們還發(fā)現(xiàn)HSPN血漿中五聚素3表達水平與尿液中微量白蛋白、24 h尿蛋白定量呈正相關。同時，有研究表明，IgA腎病患者中腎炎型、腎病型患者蛋白尿程度越重，血漿和尿液中五聚素3表達水平升高越顯著，提示HSPN患兒血漿和尿液中五聚素3的表達水平腎損傷的嚴重程度呈正相關[21]。HSP患兒血漿及尿液中五聚素3表達水平變化的機制可能與五聚素3在血管炎癥損傷中的作用密切相關。HSP患兒血漿中白細胞介素1、白細胞介素4、腫瘤壞死因子α的表達水平顯著升高，這些細胞因子可促使五聚素3的生物合成增加。五聚素3還可以抑制巨噬細胞對晚期凋亡的中性粒細胞的吞噬作用，導致其在血管壁聚集，HSP時五聚素3的高表達水平有助于延遲凋亡中性粒細胞的清除，促進白細胞碎裂性血管炎的形成[22]。五聚素3亦屬于成纖維細胞生長因子家族：成纖維細胞生長因子2和成纖維細胞生長因子8b的天然選擇性拮抗劑，五聚素3對成纖維細胞生長因子2的特異性抑制作用能達到抗血管生成的效果。一氧化氮通路的受損是導致內(nèi)皮功能障礙的主要機制之一[23]，在實驗模型中，五聚素3通過P-選擇素/基質(zhì)金屬蛋白酶1途徑，使小鼠抵抗血管內(nèi)皮功能受損，從而引起內(nèi)皮細胞形態(tài)學改變和一氧化氮通路的受損。而在HSPN中，HSP血漿及尿液中的機制同樣可以解釋，有研究表明，HSPN和IgA腎病患者血漿半乳糖缺陷的IgA1(galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1)水平顯著升高，這提示Gd-IgA1在HSPN的發(fā)病機制中起到關鍵作用，Gd-IgA1免疫復合物在腎小球系膜區(qū)沉積，可激活系膜細胞，而系膜細胞的活化可促進五聚素3的生成[24]。此外，炎性細胞因子可以誘導腎小球上皮細胞合成五聚素3。

綜上所述，五聚素3表達水平的檢測不僅能反映HSP疾病的活動狀態(tài)，還可能成為HSP患兒腎損傷的一項新的檢測指標。