高夢(mèng)詩(shī)，鄭敏子，葉心怡，施國(guó)邦，闕祥潔，張隆超，孫漩嶸

（浙江工業(yè)大學(xué)長(zhǎng)三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310014）

含氮雜環(huán)化合物具有毒性低、內(nèi)吸附性高等優(yōu)點(diǎn)，因具有類似體內(nèi)生物堿（如嘌呤和嘧啶等）的結(jié)構(gòu)，對(duì)靶標(biāo)具有高度的專一性，常被用做醫(yī)藥和農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)組成單元。現(xiàn)有研究表明，含氮雜環(huán)化合物在抗腫瘤［1-2］、消炎［3-4］、抗菌［5-6］、抗病毒［7］等方面表現(xiàn)出良好的生物活性。目前常采用不同的修飾基團(tuán)對(duì)含氮雜環(huán)化合物進(jìn)行修飾，以期發(fā)現(xiàn)可以作為候選藥物的先導(dǎo)化合物，促進(jìn)新藥開(kāi)發(fā)和研究。

二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類化合物（圖1）作為一類重要的含氮雜環(huán)化合物，可作為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1（cell cycle checkpoint kinase 1，Chk1）抑制劑，具有潛在的抗腫瘤活性［8］。2016年，徐麗［9］將4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）催化合成得到的12個(gè)二氫吡喃并［2，3-c］吡唑衍生物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行了體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明具有一定的抑瘤作用。

Fig.1 Structural skeleton of dihydropyran ［2，3-c］pyrazole compound.

2016年，蘇為科教授課題組［10］通過(guò)多組分一鍋法制備得到多種新型二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類衍生物，本研究對(duì)其中第36號(hào)衍生物（后稱36號(hào)化合物，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2）的體外抑瘤作用和可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，旨在為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和體內(nèi)抗腫瘤活性研究等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

36號(hào)化合物分子式為C23H22N4O，相對(duì)分子質(zhì)量370.45，熔點(diǎn)為149～151℃。以二甲亞砜（DMSO）制備36號(hào)化合物母液（100 g·L-1），4℃保存，臨用時(shí)用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

Fig.2 Molecular structure of No.36 dihydropyran［2，3-c］pyrazole derivative（No.36 Compound）

RPMI 1640培養(yǎng)基、0.5%胰酶細(xì)胞消化液、基因組RNA提取試劑盒（K0731）和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）購(gòu)自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物技術(shù)股份有限公司；磷酸緩沖鹽溶液購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；青-鏈霉素溶液購(gòu)于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；SYBR Green qPCR Mix（2×）、AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和JC-1線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

倒置生物顯微鏡TS100-F購(gòu)自尼康株式會(huì)社，BB150 CO2培養(yǎng)箱和Veriti 96 PCR儀購(gòu)自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司，TGL-20000cR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠，D3024高速微量離心機(jī)購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司，ACEA NovoCyte流式細(xì)胞儀購(gòu)自艾森生物（杭州）有限公司，F(xiàn)lexStation多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于無(wú)錫耐思生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37和MCF-7及人肺癌細(xì)胞A549均由浙江省人民醫(yī)院隋梅花教授饋贈(zèng)。用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，0.5%胰酶消化傳代。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活

上述3種細(xì)胞以每孔1×104細(xì)胞分別接種于96孔板，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組和給藥組，另設(shè)空白對(duì)照組（不含細(xì)胞），每組設(shè)3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至＞50%融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，分別加入含終濃度為0（正常對(duì)照組），1，5，12.5，25，50和100 mg·L-1的36號(hào)化合物培養(yǎng)液，孵育48 h，而后每孔加入MTT（5 g·L-1）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光度（A570nm）值。細(xì)胞存活率（%）=（給藥組A570nm-空白對(duì)照組A570nm）/（正常對(duì)照組A570nm-空白對(duì)照組A570nm）×100%。根據(jù)不同濃度36號(hào)化合物作用下的細(xì)胞存活率，用SPSS 22.0進(jìn)行Probit回歸得其體外抑制各腫瘤細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

將Bcap-37細(xì)胞以每孔5×105細(xì)胞接種于6孔板，分為正常對(duì)照組和給藥組。分別加入終濃度為0和50 mg·L-1的36號(hào)化合物培養(yǎng)液，孵育48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞。參照基因組RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，移取總RNA 1 μL并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)條件為：25℃，5 min；45℃，60 min；70℃，5 min。嚴(yán)格按照PCR儀Veriti 96說(shuō)明書(shū)操作，并根據(jù)SYBR Green qPCR Mix（2×）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凋亡相關(guān)基因p21，p53，Bax和NF-κB的擴(kuò)增，以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。設(shè)置PCR反應(yīng)程序，預(yù)變性：95℃，2 min；變性：95℃，15 s；退火/延伸：60℃，30 s；共40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：95℃，15 s。每一樣本同時(shí)設(shè)3復(fù)孔，輸出數(shù)據(jù)為復(fù)孔Ct值的平均值，待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt表示。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Sequence of primers

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

將Bcap-37細(xì)胞以每孔5×105細(xì)胞接種于6孔板，將細(xì)胞分為給藥組和正常對(duì)照組，每組設(shè)2復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)所得IC50，分別加入含終濃度為0和25 mg·L-1的36號(hào)化合物的培養(yǎng)液，孵育36 h后，胰酶消化細(xì)胞。按細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明向細(xì)胞懸浮液中加入PI染色液，37℃避光溫育30 min，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期，艾森NovoExpress流式軟件處理得細(xì)胞周期分布圖。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將Bcap-37細(xì)胞以每孔5×105細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞分為正常對(duì)照組和給藥組，每組設(shè)2復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至＞80%融合度時(shí)，分別加入終濃度為0，25和50 mg·L-1的36號(hào)化合物培養(yǎng)液，孵育36 h后，胰酶消化細(xì)胞。按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明向細(xì)胞懸浮液中加入AnnexinⅤ-FITC和PI染色液，室溫避光孵育20 min，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡，艾森NovoExpress流式軟件處理得凋亡散點(diǎn)圖。

1.7 JC-1探針檢測(cè)線粒體膜電位

將Bcap-37細(xì)胞以每孔5×105細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞分為正常對(duì)照組和給藥組，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組〔細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP），10 μmol·L-1〕，每組設(shè)3 復(fù)孔。分別加入含終濃度0，10，25和75 mg·L-136號(hào)化合物的培養(yǎng)液，孵育24 h后，按照J(rèn)C-1 MMP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)相應(yīng)熒光通道的發(fā)射熒光強(qiáng)度值（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。檢測(cè)JC-1單體時(shí)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為538 nm（綠色熒光）；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為544 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm（紅色熒光）。以FI紅/FI綠比值反映線粒體膜電位的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 36號(hào)化合物對(duì)Bcap-37，MCF-7和A549細(xì)胞存活率的影響

如圖3所示，36號(hào)化合物對(duì)Bcap-37，MCF-7和A549細(xì)胞存活均表現(xiàn)出抑制作用，且隨濃度的增加，抑制細(xì)胞存活的作用增強(qiáng)。作用48h，抑制3種腫瘤細(xì)胞存活的IC50分別為22.4±0.8，35.7±1.2和（30.1±2.9）mg·L-1。選取存活率受36號(hào)化合物影響最大的Bcap-37細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，初步探索36號(hào)化合物可能的作用機(jī)制。

Fig.3 Effect of No.36 Compound on viability of Bcap-37，MCF-7 and A549 cells by MTT assay.Cells were treated with No.36 Compound 1，5，12.5，25，50 and 100 mg·L-1for 48 h，respectively.Cell viability（%）=（A570 nmof experimental group-A570 nmof blank group）/A570 nmof normal control group-A570 nm of blank group）×100%.±s，n=3.

2.2 36號(hào)化合物對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果（圖4）顯示，與正常對(duì)照組相比，36號(hào)化合物50 mg·L-1組Bcap-3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p21，p53，Bax和NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of No.36 Compound on mRNA relative expression of apoptosis-related genes p21，p53，Bax and NF-κ B in Bcap-37 cells detected by RT-PCR.Bcap-37 cells were treated with No.36 Compound 50 mg·L-1for 36 h.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 36號(hào)化合物對(duì)Bcap-37細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，相對(duì)于正常對(duì)照組，36號(hào)化合物25 mg·L-1組細(xì)胞G1期比例顯著增加（P＜0.01），S期和G2期比例均有所下降。推測(cè)其可誘導(dǎo)Bcap-37細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。

Fig.5 Effect of No.36 Compound on cell cycle of Bcap-37 cells detected by flow cytometry.Bcap-37 were treated with No.36 Compound 25 mg·L-1for 36 h.B was the semi-quan?titative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 36號(hào)化合物對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡的影響

圖6和表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，36號(hào)化合物25和50 mg·L-1處理細(xì)胞36 h后，各組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯凋亡，且隨化合物濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡/壞死細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01）。

Fig.6 Effect of No.36 Compound on apoptosis of Bcap-37 cells by flow cytometry.Bcap-37 cells were treated with No.36 Compound 25 and 50 mg·L-1for 36 h.

Tab.2 Effect of No.36 Compound on apoptotic propor?tion of Bcap-37 cells

2.5 36號(hào)化合物對(duì)Bcap-37細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖7所示，36號(hào)化合物10，25和75 mg·L-1處理細(xì)胞24 h后，隨濃度增加，F(xiàn)I紅/FI綠較正常對(duì)照組顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），提示 MMP 降低。與CCCP組相比，36號(hào)化合物75 mg·L-1組Bcap-37細(xì)胞MMP顯著降低（P＜0.05）。

Fig.7 Effect of No.36 Compound on mitochondrial membrane potential（MMP）of Bcap-37 cells by JC-1 fluorescent probe.Bcap-37 cells were treated with No.36 Compound 10，25 and 75 mg·L-1or carbonyl cyanide m-chloro?phenylhydrazone（CCCP）10 μmol·L-1for 24 h，respectively.FI：fluorescence intensity.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CCCP group.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新型二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類衍生物——36號(hào)化合物可抑制人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37的體外增殖，表明其具有一定的細(xì)胞毒性。p53是人體內(nèi)最重要的抑癌基因之一，具有阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用［11］。其產(chǎn)物P53蛋白能與特異性DNA序列結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，同時(shí)調(diào)控下游多個(gè)參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的基因的表達(dá)［12］。Bax是Bcl-2基因家族中最主要的細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因之一，被認(rèn)為是p53直接的早期應(yīng)答基因［13］。Bax蛋白可與Bcl-2形成異源二聚體，起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［14］。p21基因是p53最重要的下游基因之一，細(xì)胞受損時(shí)，P53激活p21基因表達(dá)，進(jìn)而降低細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）-周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）復(fù)合物的活性，導(dǎo)致成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（retinoblasto?ma protein，RB）磷酸化水平降低［15-17］，從而使細(xì)胞阻滯在G1期。RT-PCR結(jié)果證實(shí)，在36號(hào)化合物作用下，Bcap-37細(xì)胞中促凋亡基因p53，p21和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著增加。而NF-κB作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控機(jī)制多樣，在不同調(diào)節(jié)下可表現(xiàn)出抑癌或促癌作用［18-20］。研究表明，NF-κB，特別是其P65（RelA）亞基，在P53介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用，NF-κB失活或活性降低可減弱P53誘導(dǎo)的凋亡［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，在36號(hào)化合物作用下，Bcap-37細(xì)胞中NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)水平增加，起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，36號(hào)化合物可阻滯Bcap-37細(xì)胞于G1期，抑制DNA合成，引起細(xì)胞早期凋亡。

Hengartner［22］認(rèn)為，MMP 下降是早期凋亡的標(biāo)志性事件，正常細(xì)胞中線粒體通透性轉(zhuǎn)變通道（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）存在周期性開(kāi)放以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，而在凋亡階段，mPTP過(guò)度開(kāi)放導(dǎo)致膜間隙的正離子不斷進(jìn)入基質(zhì)，破壞原有的離子濃度梯度，使得膜電位下降或消失，嚴(yán)重影響呼吸鏈脫偶聯(lián)和ATP合成等正常生理活動(dòng)，進(jìn)一步促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)因子等的釋放。促凋亡基因Bax受到凋亡刺激后可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體上［23］，引發(fā)細(xì)胞色素c的釋放，激活胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)［24-25］，引起細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度36號(hào)化合物使Bcap-37細(xì)胞膜電位顯著下降，且具有濃度依賴性；與凋亡誘導(dǎo)劑CCCP作用效果相比，膜電位下降明顯。推測(cè)在36號(hào)化合物刺激下，Bcap-37細(xì)胞mPTP過(guò)度開(kāi)放，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡，該結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡得到的結(jié)果相吻合，即36號(hào)化合物可誘發(fā)Bcap-37細(xì)胞早期凋亡。

綜上所述，該新型二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類衍生物對(duì)體外培養(yǎng)的Bcap-37細(xì)胞具有顯著的抑制作用，其引起的癌細(xì)胞早期凋亡可能由細(xì)胞內(nèi)線粒體通路和細(xì)胞外凋亡信號(hào)通路共同介導(dǎo)，具有潛在的抗腫瘤活性，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，但該化合物的體內(nèi)抑瘤作用和具體作用靶點(diǎn)等還有待進(jìn)一步研究。