彭培佩＊，王 ?。?，陳 晨3，，黃 芳，王 芃，李山虎，王 輝

（1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023；4.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083）

p70核糖體S6激酶β-1（ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1）屬于蛋白激酶A/蛋白激酶G/蛋白激酶C家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)西羅莫司（雷帕霉素）復(fù)合物1〔mammalian target of sirolimus（Rapamycin）complex 1，mTORC1〕蛋白激酶下游的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)［1-2］，而作為40S核糖體亞基組成部分的S6蛋白是S6K1最重要的底物之一［3］。通常認(rèn)為，mTORC1-S6K1信號(hào)軸調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞代謝等過(guò)程。因此，S6K1在包括肥胖、糖尿病、衰老和癌癥等許多疾病中起重要作用，研究者已提出通過(guò)抑制該激酶活性來(lái)治療癌癥和胰島素抗性的策略［4-5］。

PF-4708671是S6K1的特異性抑制劑，通過(guò)誘導(dǎo)依賴于mTORC1的S6K1的T環(huán)和疏水基序的磷酸化，進(jìn)而抑制S6K1底物S6蛋白的磷酸化［6］。研究表明，PF-4708671能抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ，導(dǎo)致線粒體功能異常，并誘導(dǎo)過(guò)量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，通過(guò)激活胱天蛋白酶或釋放細(xì)胞色素c，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［6-8］。另外，最近的研究還發(fā)現(xiàn)，PF-4708671也可通過(guò)減少抗凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)對(duì)他莫昔芬耐藥的MCF-7細(xì)胞死亡［9-11］。

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的傳導(dǎo)通路之一，與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡密切相關(guān)［12］。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在多種癌癥中被激活，其激活機(jī)制包括腫瘤抑制因子磷酸酶和張力蛋白同源性（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因功能的喪失、PI3K的擴(kuò)增或突變、AKT的擴(kuò)增或突變和生長(zhǎng)因子受體的激活等［13］。一系列臨床研究均表明，mTOR激酶抑制劑（如西羅莫司及其衍生物依維莫司等）可用于治療如食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、腎細(xì)胞癌和前列腺癌等實(shí)體瘤，而許多PI3K/AKT/mTOR信號(hào)分子的靶向性藥物也正處于臨床前開(kāi)發(fā)或早期臨床試驗(yàn)階段［13-14］。但臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，mTOR激酶抑制劑西羅莫司和依維莫司在抑制S6K1活性的同時(shí)能反饋激活A(yù)KT信號(hào)通路，繼而通過(guò)調(diào)控Bcl-2、叉頭框蛋白家族因子、凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）、胱天蛋白酶9、糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）、結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2（tuberous sclerosis complex 2，TSC-2）等分子活性抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖等作用減弱治療效果［15-17］。為此，本研究通過(guò)探索S6K1抑制劑PF-4708671調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的作用機(jī)制，提出與NVP-BEZ235聯(lián)合用藥的策略，以期對(duì)腫瘤靶向性治療臨床用藥提供有益的線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和主要儀器

感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-436和肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自美國(guó)ATCC；西羅莫司（sirolimus）、PF-4708671和NVP-BEZ235購(gòu)于美國(guó)Selleck公司；山羊抗微管蛋白（γ-Tubulin）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗磷酸化AKT473（p-AKT473），p-S6，AKT和S6K1多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；山羊抗兔和兔抗山羊IgG抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；二甲亞砜（DMSO）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)于華北制藥有限公司；嘌呤霉素購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；蛋白酶抑制劑和甲紫（結(jié)晶紫）購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；BCA蛋白定量試劑盒、CO2恒溫培養(yǎng)箱和MULTISKAN FC酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；ECL發(fā)光液購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；Cell Counting Kit 8（CCK8）試劑盒購(gòu)于東仁化學(xué)科技有限公司；Lipo3000試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾中國(guó)；5417R低溫高速離心機(jī)及5418臺(tái)式室溫離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；電泳槽和濕轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)Biorad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-436和A549細(xì)胞均用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1和鏈霉素0.1 g·L-1的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度長(zhǎng)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［18］，利用PLKO.1載體設(shè)計(jì)干擾S6K1表達(dá)的短發(fā)夾RNA（sh-S6K1），引物序列為F：CC?GGGCATCGGCACCACTTCCAATACTCGAGTATT?GGAAGTGGTGCCGATGCTTTTTG；R：AATTCAAAAAGCATCGGCACCACTTCCAATACTCGAGTATTGGAAGTGGTGCCGATGC。引物由北京賽百盛生物工程公司合成，4℃保存。使用PLKO.1載體按膠回收試劑盒（Axygen公司）說(shuō)明書進(jìn)行酶切回收，將設(shè)計(jì)的短序列進(jìn)行退火連接，將載體片段和退火片段通過(guò)T4連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物利用大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂氨芐平板，挑單克隆搖菌，按質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen公司）說(shuō)明書提取質(zhì)粒，并測(cè)定濃度，-20℃保存。送生物工程（上海）股份有限公司北京測(cè)序部得到測(cè)序結(jié)果。按照Lipo3000試劑盒說(shuō)明書操作，獲得穩(wěn)定敲低S6K1表達(dá)的MDA-MB-436和A549細(xì)胞。

1.4 Western蛋白印跡法檢測(cè)p-AKT473，AKT和S6K1蛋白水平

在接種MDA-MB-436和A549細(xì)胞的培養(yǎng)皿內(nèi)加入終濃度為30 μmol·L-1的PF-4708671，處理0，1，3，6，12和24 h后收取細(xì)胞；以及單獨(dú)或聯(lián)合加入PF-4708671（30 μmol·L-1）或西羅莫司（10 nmol·L-1）處理24 h后收取細(xì)胞；向接種敲低S6K1的上述2種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入終濃度為30 μmol·L-1的PF-4708671，處理24 h后收取細(xì)胞；以及單獨(dú)或聯(lián)合加入 PF-4708671 30 μmol·L-1或 NVP-BEZ235 100 nmol·L-1，處理24 h后收取細(xì)胞；用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，利用BCA比色法在酶標(biāo)儀570 nm處檢測(cè)吸光度（A570nm）值，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白樣品的濃度。向蛋白樣品中加入5×SDS加樣緩沖液并煮沸8 min，對(duì)蛋白進(jìn)行預(yù)變性處理。以10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品后，在濕轉(zhuǎn)裝置中以200 mA進(jìn)行恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h，在5%脫脂奶粉中封閉約30 min。使用5%的脫脂奶粉稀釋一抗（p-AKT473，AKT和S6稀釋比例為1∶1000，p-S6稀釋比例為1∶3000），在4℃的搖床上孵育過(guò)夜。用TBST洗膜3次后加入二抗（稀釋比例1∶5000）室溫孵育6 h，之后用TBST洗膜3次，每次5 min，以ECL法顯影及定影。膠片經(jīng)掃描后用Image J進(jìn)行積分吸光度分析。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述2種細(xì)胞消化后，按每孔分別3500和2500細(xì)胞接種到96孔板中，每孔重復(fù)3次，置于CO2培養(yǎng)箱24 h后，各孔單獨(dú)加入0，10，20，30和40 μmol·L-1的PF-4708671或聯(lián)合加入 NVP-BE235（MDA-MB-436：8 nmol·L-1；A549：1 μmol·L-1）抑制劑72 h后去除原孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL稀釋后的CCK8工作液（按CCK8原液與培養(yǎng)液1∶9的比例配制）繼續(xù)孵育2 h，而后利用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（A450nm）值，細(xì)胞存活率（%）=（加藥組A450nm-空白組A450nm）/（正常對(duì)照組A450nm-空白組A450nm）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述2種細(xì)胞按每孔3000細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，待孔內(nèi)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)到一定大小時(shí)，單獨(dú)或聯(lián)合加入PF-4708671（30 μmol·L-1）和NVP-BEZ235（100 nmol·L-1），6 d后去除原培養(yǎng)液，加入PBS洗滌3次，加入甲醇固定細(xì)胞層約30 min，加入甲紫染液染色30 min，用流水緩慢清洗孔內(nèi)剩余染料后放置于室內(nèi)風(fēng)干。顯微鏡下計(jì)數(shù)≥10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以±s表示。使用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Studentt檢驗(yàn)（或校正t檢驗(yàn)）用于兩組間比較；單因素方差分析進(jìn)行多組比較，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Chou-Talalay方法分析聯(lián)合用藥后的聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI），定量描述聯(lián)合用藥的相加作用（CI=1）、協(xié)同作用（CI＜1）以及拮抗作用（CI＞1）。

2 結(jié)果

2.1 PF-4708671對(duì)MDA-MB-436和A549細(xì)胞中p-S6及AKT表達(dá)水平的影響

Western蛋白印跡結(jié)果（圖1）顯示，PF-4708671 30 μmol·L-1作用于上述2種細(xì)胞后，p-S6蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），而p-AKT473蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），同時(shí)AKT總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異（圖1A，C）。表明S6K1抑制劑PF-4708671抑制上述2種細(xì)胞中S6磷酸化水平的同時(shí)能反饋激活A(yù)KT活性。

Fig.1 Effect of PF-4708671（PF）on protein expression levels of protein kinase B（AKT），p-AKT473，S6 and p-S6 in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells by Western blotting.Cells were treated with PF 30 μmol·L-1for 0，1，3，6，12 and 24 h，respectively.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C，respectively.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with p-AKT473 in 0 h group；##P＜0.01，compared with p-S6 in 0 h group.

2.2 PF-4708671和西羅莫司聯(lián)用對(duì)MDA-MB-436和A549細(xì)胞中p-S6及AKT表達(dá)水平的影響

Western蛋白印跡結(jié)果（圖2）顯示，單用或聯(lián)用mTOR抑制劑西羅莫司10 nmol·L-1和PF-4708671 30 μmol·L-1作用上述2種細(xì)胞，均能抑制p-S6活性并導(dǎo)致AKT反饋激活（P＜0.01）；當(dāng)兩者聯(lián)用時(shí)，對(duì)p-S6活性有進(jìn)一步的抑制（P＜0.01），且進(jìn)一步激活了AKT活性（P＜0.01），AKT總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異（圖2A，C）。表明在上述2種細(xì)胞中，西羅莫司和PF-4708671在抑制S6K1活性的同時(shí)都能導(dǎo)致AKT反饋激活，且具有疊加作用。

2.3 PF-4708671對(duì)敲低S6K1的MDA-MB-436和A549細(xì)胞中S6K1及AKT表達(dá)水平的影響

Western蛋白印跡結(jié)果（圖3）顯示，敲低S6K1后，ATK活性相較于野生型細(xì)胞明顯上升（P＜0.01）；用PF-4708671作用野生型細(xì)胞時(shí)，能導(dǎo)致p-AKT473表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），但用PF-4708671作用于敲低S6K1后的上述2種細(xì)胞時(shí)，其對(duì)p-AKT473的表達(dá)水平增加的程度明顯低于PF-4708671作用野生型細(xì)胞中p-AKT473增加的水平（P＜0.01）（圖3E），同時(shí)AKT總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異（圖3A，C）。這一研究表明，敲低S6K1后的確能顯著增加p-AKT473表達(dá)水平，同時(shí)PF-4708671可通過(guò)抑制S6K1激活A(yù)KT活性。

Fig.2 Effect of PF combined with sirolimus（Sir）on protein expression levels of p-AKT473，AKT，S6 and p-S6 in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells by Western blotting.Cells were treated with PF（30 μmol·L-1，24 h）and Sir（10 nmol·L-1，24 h）alone or in combination.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal control（NC）group.

Fig.3 Effect of PF on ribosomal protein S6 kinase beta-1（S6K1）and p-AKT473 expression levels in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells after S6K1 was knocked down by small interfering RNA（sh-S6K1）by Western blotting.The sh-S6K1 cells were treated with PF 30 μmol· L-1for 24 h.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C，respectively.E was the changes in p-AKT473 expression in wild-type（WT）and sh-S6K1 cells after being treated with PF，and was the semi-quantitative analysis of A and C.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding NC group；△△P＜0.01，compared with corre?sponding WT group.

2.4 PF-4708671聯(lián)合NVP-BEZ235對(duì)MDA-MB-436和A549克隆形成和細(xì)胞存活的影響

Western蛋白印跡結(jié)果（圖4）顯示，PI3K/mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235可顯著抑制由PF-4708671所導(dǎo)致的p-AKT473活性增強(qiáng)（P＜0.01）。平板克隆結(jié)果（圖5A-D）顯示，與單用PF-4708671或NVP-BEZ235相比，兩者聯(lián)合處理后MDA-MB-436及A549細(xì)胞的克隆形成數(shù)顯著降低（P＜0.01）。CCK8結(jié)果（圖5E，F(xiàn)）表明，與正常對(duì)照組相比，單用PF-4708671及NVP-BEZ235均具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果（P＜0.01），但2種抑制劑聯(lián)用時(shí)，顯著增強(qiáng)了抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用（P＜0.01），且兩藥聯(lián)用存在協(xié)同作用（CI＜1）。

Fig.4 Effect of PF combined with NVP-BEZ235（BEZ）on expression levels of AKT，p-AKT473，S6 and p-S6 kinase in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells by Western blotting.The cells were treated with PF（30 μmol·L-1，24 h）and BEZ（100 nmol·L-1，4 h）.B and D was the semi-quantitative analysis of A or C，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding NC group.

Fig.5 Effect of PF combined with BEZ on clonal formation and cell survival of MDA-MB-436（A，B，E）and A549（C，D，F(xiàn)）.A and C：the cells were treated with PF（MDA-MB-436：20 μmol·L-1；A549：60 μmol·L-1）and BEZ（MDA-MB-436：8 nmol·L-1；A549：20 nmol·L-1）alone or in combination for cloning experiment respectively.B and D：count analysis of each hole for A and C.E and F：the cells were treated with the indicated concentrations gradient of PF with BEZ（MDA-MB-436：8 nmol·L-1；A549：1 μmol·L-1）alone or in combination for cell survival assay.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with NC group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PF+BEZ group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，S6K1抑制劑PF-4708671和PI3K/mTOR激酶抑制劑NVP-BEZ235聯(lián)用于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-436和肺癌細(xì)胞A549，可顯著增強(qiáng)單用時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，因而被認(rèn)為是靶向性治療的有效靶點(diǎn)，但是常常由于受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK）信號(hào)增強(qiáng)，或和其他促生長(zhǎng)信號(hào)通路之間的交互作用，導(dǎo)致耐藥性和不良預(yù)后的發(fā)生［19-21］。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活下游的S6K1以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖［22］。有研究發(fā)現(xiàn)，激活的S6K1可抑制PI3K上游調(diào)控分子胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）的功能活性，導(dǎo)致PI3K/AKT通路無(wú)法被正常激活而表現(xiàn)出一種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制［2］。因此，當(dāng)用西羅莫司抑制mTORC1會(huì)解除S6K1反饋抑制環(huán)路而導(dǎo)致AKT的持續(xù)激活，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)西羅莫司產(chǎn)生耐藥性，減弱其潛在的抗癌活性［23］。但也有研究對(duì)此結(jié)論提出了質(zhì)疑。Wang等［24］研究發(fā)現(xiàn)，用S6K1抑制劑或者直接敲低S6K1表達(dá)都不能激活A(yù)KT活性，進(jìn)而認(rèn)為西羅莫司或mTORC1抑制劑不是通過(guò)解除IRS-1/PI3K/AKT信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)控來(lái)激活A(yù)KT活性。而本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S6K1抑制劑PF-4708671和西羅莫司具有相似的作用分子機(jī)制，都可以通過(guò)抑制S6K1活性來(lái)激活A(yù)KT活性。本研究首先發(fā)現(xiàn)，用S6K1抑制劑PF-4708671處理MDA-MB-436和A549細(xì)胞后抑制S6K1活性同時(shí)相應(yīng)激活了AKT活性；而通過(guò)敲低腫瘤細(xì)胞中S6K1表達(dá)，可直接上調(diào)AKT磷酸化水平，說(shuō)明S6K1直接參與了負(fù)調(diào)控ATK活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在敲低S6K1表達(dá)的突變型細(xì)胞中，PF-4708671依然能激活A(yù)KT活性；但相對(duì)于野生型細(xì)胞而言，PF-4708671對(duì)ATK的激活程度顯著減弱，這都提示PF-4708671激活A(yù)KT活性的分子機(jī)制可能是通過(guò)抑制S6K1活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

由于AKT的激活經(jīng)常與細(xì)胞生存和抗癌治療有關(guān)，因而認(rèn)為PF-4708671作用下的AKT激活也會(huì)減弱PF-4708671的抗腫瘤作用。因此，本研究首先證實(shí)PF-4708671對(duì)AKT的反饋激活可被PI3K和mTOR雙重ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑NVP-BEZ235所阻斷，在此基礎(chǔ)上提出了聯(lián)合用藥的策略。研究結(jié)果證實(shí)，在PF-4708671和NVP-BEZ235聯(lián)用時(shí)顯著增強(qiáng)PF-4708671單用對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。因此，對(duì)于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路異常激活所導(dǎo)致的腫瘤，可通過(guò)聯(lián)用S6K1抑制劑和PI3K/AKT抑制劑來(lái)增強(qiáng)靶向性治療的效果。