史夏青,劉玲,王成志,廖明媚,楊滿意,趙勁風
(中南大學湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術重點實驗室,湖南 長沙 410008)
肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,死亡率居于癌癥的首位,其發(fā)病率在許多發(fā)展中國家迅速上升[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌,占肺癌病例約85%[3]。近些年肺癌治療已經(jīng)在分子診斷和靶向治療方面取得進展,但其臨床治療效果仍然很差,5年生存率低于15%[4]。長期吸煙是導致肺癌發(fā)生及耐藥的主要因素,尼古?。∟icotine)是香煙煙霧中的主要成分,其可以通過調(diào)控細胞內(nèi)各種不同信號通路來促進癌細胞增殖,并對化學治療(以下簡稱化療)藥物導致的癌細胞凋亡起抑制作用[5]。本研究探討Nicotine對人肺腺癌細胞A549化療敏感性以及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bak和Mcl-1表達水平的影響。
A549細胞(上海中國科學院細胞庫)。順鉑(cisplatin, CDDP)、Nicotine、MTT(美國Sigma公司),RPMI 1640培養(yǎng)基和青、鏈霉素(美國Gibco公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)[依科賽生物科技(太倉)有限公司],DMSO(北京索萊寶科技有限公司),Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司),一抗 p-Mcl-1(T163)、Mcl-1、Bak、GAPDH 和 二 抗(美國Cell Signaling Technology公司),Bcl-2(英國Abcam公司),BCA試劑盒(美國賽默飛公司)。細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司),F(xiàn)ACS-Canto流式細胞儀(美國BD公司),全波長酶標儀(美國BioTek Epoch公司),電泳儀(美國BIORAD公司),F(xiàn)luor Chem R多功能成像分析系統(tǒng)(美國Protein Simple公司)。
1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)于含10%FBS,1%青霉素和鏈霉素,RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱。
1.2.2 MTT法檢測細胞活力 將對數(shù)生長期的A549細胞接種于96孔板,每孔5 000個細胞,每組3個復孔。待細胞貼壁后,在有或無Nicotine處理的條件下,加入含有不同濃度CDDP(0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及40.0 μmol/L)的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時設空白組(只含有等量培養(yǎng)基)和對照組(含同數(shù)量細胞和等量培養(yǎng)基),每孔加入10μl MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加入100 μl DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,用酶標儀490 nm處測量各孔的吸光值。
1.2.3 Annexin V/PI檢測細胞凋亡 取處于對數(shù)生長期的A549細胞,調(diào)整細胞密度為1×104個/ml,以2 ml/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板,加入5 μmol/L Nicotine處理2 h,加入含有7 μmol/L CDDP的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細胞并使用冷的PBS緩沖液洗細胞2次,再用1×Binding Buffer緩沖液制成100 μl的1×106個/ml的細胞懸液,加入Annexin V與PI輕輕混勻,室溫20~25 ℃避光處放置15 min后,加入1×Binding Buffer緩沖液400 μl,1 h內(nèi)上流式細胞儀測定結(jié)果。
1.2.4 Western blotting檢測凋亡相關蛋白 收集處理后的細胞,提取細胞總蛋白,10%的SDS-PAGE凝膠電泳,250 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5% BSA封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,二抗孵育1 h,TBST洗膜3次,ECL化學發(fā)光顯影。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較采用方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
5 μmol/L Nicotine處理A549細胞2 h后,不同濃度的(0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及 40.0 μmol/L)CDDP分別處理A549細胞48 h,CDDP能降低A549細胞的存活率,且具有劑量依賴性,隨著濃度增加細胞存活率逐漸降低(P<0.05)。CDDP+Nicotine組的細胞存活率較CDDP組的細胞存活率高。見表1。
對照組、CDDP組和CDDP+Nicotine組的細胞凋亡率分別為(3.94±1.15)%、(14.75±2.17)%和(9.53±0.86)%。經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=38.626,P=0.000)。CDDP組 和CDDP+Nicotine組細胞凋亡率均大于對照組(P<0.05);CDDP組 和CDDP+Nicotine組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),CDDP+Nicotine組的細胞凋亡率降低。見圖1。
表1 CDDP和CDDP+Nicotine對A549細胞存活率的影響 (n =3,%,±s)
表1 CDDP和CDDP+Nicotine對A549細胞存活率的影響 (n =3,%,±s)
注:1)與 0.0 μmol/L 比較,P <0.05;2)與 CDDP 組比較,P <0.05
組別 0.0 μmol/L 2.5 μmol/L 5.0 μmol/L 10.0 μmol/L 20.0 μmol/L 40.0 μmol/L F值 P值CDDP組 1.00±0.08 70.77±0.331) 55.41±2.601) 39.49±3.211) 31.37±2.421) 23.22±3.221) 237.987 0.000 CDDP+Nicotine 組 1.00±0.08 77.02±1.971) 71.03±2.371)2) 52.44±3.061)2) 35.58±1.841)2) 29.89±5.561) 60.985 0.000
圖1 Nicotine與COPD對A549細胞凋亡影響
結(jié)果見圖2和表2、3。5 μmol/L Nicotine處理A549細胞不同時間(0.0、0.5、1.0及2.0 h)后,A549細胞的p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2和Bak的表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
圖2 Nicotine影響A549的凋亡相關蛋白的表達水平
表2 5 μmol/L Nicotine處理不同時間后對A549細胞凋亡相關蛋白的表達 (n =3,±s)
表2 5 μmol/L Nicotine處理不同時間后對A549細胞凋亡相關蛋白的表達 (n =3,±s)
注:?與0.0 h處理組比較,P <0.05
蛋白 0.0 h 0.5 h 1.0 h 2.0 h F值 P值p-Mcl-1 5.48±2.34 23.65±3.37? 34.24±1.73? 65.65±2.71? 273.899 0.000 Mcl-1 41.62±2.00 63.73±2.80? 87.44±4.03? 97.50±2.91? 98.699 0.000 Bcl-2 9.33±1.00 17.05±1.15? 23.51±0.87? 34.21±2.26? 38.323 0.000 Bak 6.15±0.27 6.16±0.39 6.24±0.39 6.39±0.22 0.335 0.801
表3 Nicotine和CDDP聯(lián)合處理后A549細胞凋亡相關蛋白的表達 (n =3,±s)
表3 Nicotine和CDDP聯(lián)合處理后A549細胞凋亡相關蛋白的表達 (n =3,±s)
注:1)與對照組比較,P <0.05;2)與CDDP組比較,P <0.05
組別 p-Mcl-1 Mcl-1 Bcl-2 Bak對照組 23.02±1.76 94.26±1.55 25.52±3.64 7.15±2.13 CDDP 組 15.58±1.251) 21.84±1.931) 9.42±0.641) 13.55±2.711)CDDP+Nicotine 組 22.18±1.841)2) 88.21±4.501)2) 70.38±3.741)2) 15.05±0.391)F值 23.830 52.811 41.143 96.150 P值 0.001 0.000 0.000 0.000
Nicotine和CDDP聯(lián)合處理后,CDDP+Nicotine組A549細胞的p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2和Bak的表達,CDDP組較對照組的p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2的表達均降低,Bak的表達升高。較CDDP組p-Mcl-1、Mcl-1、Bcl-2的表達均升高,Bak的表達無變化。
肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤,超過乳腺癌,前列腺癌和結(jié)腸癌的總和[6]。到目前為止,許多治療手段,如手術、放化療、免疫治療和其他一些有針對性的方法已應用于肺癌治療[7]。CDDP是用于治療各種人類惡性腫瘤最有效和廣泛使用的DNA損傷抗癌藥物之一。然而,目前肺癌患者往往會對CDDP產(chǎn)生耐藥性,導致化療失敗[8]。因此,更好地了解肺癌中CDDP耐藥的分子機制對于肺癌的靶向治療和改善肺癌患者的預后非常必要。
吸煙是肺癌最大的危險因素,約占非小細胞肺癌的70%和小細胞肺癌的90%[9]。Nicotine是煙草中的主要成分,可致癌且令人上癮[10]。最近的報道顯示Nicotine抑制各種肺癌細胞凋亡,這暗示Nicotine不僅具有促進肺癌細胞增殖的能力,也可通過降低化療藥物的功效來促進肺癌細胞生存[11]。筆者的研究表明,Nicotine確實可以降低肺癌細胞A549對化療藥物CDDP的敏感性,減少化療過程中的肺癌細胞凋亡。
Bcl-2、Bak和Mcl-1是Bcl-2基因家族的成員,Bak是主要促凋亡蛋白,在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Mcl-1的半衰期較短,只有0.5~3.0 h。因此,延長Mcl-1蛋白半衰期對其長期促生存功能至關重要。Mcl-1蛋白可以在T163位點磷酸化,其磷酸化可以延長Mcl-1的半衰期,增強抗凋亡功能。A549細胞經(jīng)Nicotine處理后,Nicotine不僅上調(diào)Mcl-1的表達水平,還增強其T163位點磷酸化水平。因此,Nicotine促進A549細胞的增殖,還降低其化療敏感性可能通過上調(diào)Bcl-2和Mcl-1的表達,以及Mcl-1的T163位點磷酸化水平。進一步的實驗研究可以探討Mcl-1是否可以作為肺癌靶向治療的靶點或候選基因。
有研究證明Nicotine可以從肺癌細胞的乙酰膽堿受體上取代乙酰膽堿,并激活PI3K、Akt、MAPK、PKC等蛋白激酶,引起B(yǎng)cl-2家族部分蛋白的表達及其磷酸化情況發(fā)生變化[12-14]。而Nicotine是否通過激活PI3K、Akt、MAPK、PKC等蛋白激酶和Bcl-2家族蛋白誘導肺癌細胞耐藥尚不明確,進一步探索Nicotine誘導肺癌細胞耐藥的分子機制可為肺癌治療發(fā)現(xiàn)新的治療靶點,為肺癌的治療提供新的治療策略。