李明，趙卿，高峰

(1.湖南省長沙市口腔醫(yī)院,湖南 長沙 410004；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 超聲科,湖南 長沙 410013)

口腔癌是世界第6大致死性惡性腫瘤，其中約90%為口腔鱗狀細胞癌，近年來口腔癌發(fā)病率呈逐年升高趨勢。來自流行病學(xué)及臨床與基礎(chǔ)研究的多方證據(jù)表明，口腔鱗狀細胞癌與長期的化學(xué)致癌物（如煙草中的尼古丁、焦油、酒精），物理致畸變因素暴露，及病毒感染（人乳頭狀瘤病毒）等密切相關(guān)。由于口腔鱗狀細胞癌發(fā)病機制復(fù)雜，目前仍沒有特定的分子靶向藥物應(yīng)用于臨床。手術(shù)切除，結(jié)合局部放療和化療仍是口腔鱗狀細胞癌的主要治療手段。由于口腔鱗狀細胞癌具有極易早期轉(zhuǎn)移的臨床特征，口腔鱗狀細胞癌患者的5年生存率仍不足50%[1-3]。因此，闡明口腔鱗狀細胞癌的發(fā)病機制，尋找有效的藥物靶點或研發(fā)新型抗腫瘤藥物仍是目前研究的熱點。

小分子化合物由于其特有的低毒副作用，多年來備受抗腫瘤藥物篩選及研發(fā)的青睞。天然產(chǎn)物薯蕷素已被證實具有廣譜的體內(nèi)外抗腫瘤活性。薯蕷素可以通過抑制多條蛋白激酶信號通路及多個轉(zhuǎn)錄因子的功能，阻斷腫瘤賴以生存與生長的重要生物大分子的功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]。但薯蕷素抗口腔鱗狀細胞癌的分子機制及其潛在靶點還不清楚。本研究以人口腔鱗狀細胞癌TSCCa和TCA8113為研究模型，探討薯蕷素對其增殖存活的抑制作用及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

實驗用人口腔鱗狀癌細胞TSCCa和TCa8113購自中南大學(xué)醫(yī)學(xué)細胞中心。

1.1 主要試劑和抗體

薯蕷素（Dioscin，純度＞97%）購自美國Selleck公司，分子量869.04 g/mol。DMEM細胞培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Gibco公司 ,免疫印跡抗體 [包括 HK2（#2867）、PFK（#8164）、PKM2（#4053）、PARP（#9532）和 Cleaved-Caspase3（#9664）]購自美國Cell Signaling Technology公司，Glut1（ab15309）購自美國Abcam公司，β-actin（A5316）抗體購自美國Sigma公司，MTS試劑Cell Titer 96? AQueous One Solution購買自美國Promega公司，F(xiàn)lag-HK2過表達質(zhì)粒購自美國Origene公司。

1.2 MTS實驗和軟瓊脂集落形成實驗檢測薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌增殖的影響

將TSCCa和TCa8113細胞消化計數(shù)后，按照3 000個/（孔·100 μl）密度接種于96孔板。24 h后，更換含有不同濃度薯蕷素的新鮮培基至96孔板中，在薯蕷素處理后的不同時間點（24、48及72 h）加入20 μl的MTS試劑至96孔板中，并在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）檢測490 nm處吸光度值。

將配制好的2×BME培養(yǎng)基和1.25%瓊脂凝膠放置48℃水浴鍋中保溫備用。取70 ml預(yù)熱的2×BME，18 ml 1×PBS，18 ml FBS，2 ml L-Glutamine，100 μl Gentamicin以及72 ml 1.25%瓊脂凝膠混勻后即為下層瓊脂凝膠混合液，放置48℃水浴鍋保溫備用。將不同濃度的薯蕷素和下層瓊脂凝膠混勻后3 ml/孔迅速加入6孔板中，并放置在超凈臺充分凝固。將TSCCa和TCa8113細胞消化計數(shù)后，用1×BME稀釋成30 000個/ml細胞懸液。取2.4 ml下層凝膠并與1.2 ml細胞懸液及不同濃度的薯蕷素混勻后，1 ml/孔加入含有下層凝膠的6孔板中，待瓊脂凝膠完全凝固后，將6孔板放置培養(yǎng)箱中孵育2周，顯微鏡拍照并統(tǒng)計克隆數(shù)。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌糖酵解調(diào)控蛋白及凋亡調(diào)控分子表達的影響

離心收集薯蕷素處理24 h后的TSCCa和TCa8113細胞，加入300 μl RIPA（25 mmol/L Tris.HCl pH 7.6,150 mmol/L NaCl, 1% NP-40，1% sodium deoxycholate）細胞裂解液冰上裂解30 min，超聲粉碎15 s，13 000 r/min離心15 min，上清即為全細胞裂解液。用BCA試劑盒定量蛋白濃度，取30 μg蛋白進行免疫印跡分析。蛋白在SDS-PAGE電泳中分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉過夜。次日加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min。X射線曝光、顯影、定影。

1.4 葡萄糖攝取及乳酸生成效率檢測

取1×106個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)箱孵育6 h后，更換含有不同濃度薯蕷素的新鮮培養(yǎng)基，細胞在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)8 h。收集細胞培養(yǎng)上清，全自動臨床生化檢測儀檢測細胞培養(yǎng)上清內(nèi)葡萄糖和乳酸濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，不同時間點和組間的比較采用方差分析或t檢驗，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌增殖的影響

MTS結(jié)果顯示1 μmol/L薯蕷素處理細胞24 h并不能抑制TSCCa和TCa8113細胞的生長。薯蕷素對TSCCa和TCa8113細胞72 h的IC50值分別為3.65和3.02 μmol/L。隨著時間延長，1 μmol/L薯蕷素處理72 h后能抑制這2株細胞的增殖。隨著薯蕷素濃度升高，在24 h時 5 μmol/L薯蕷素即開始抑制TSCCa（F=1.518，P=0.00042）和TCa8113細胞的增殖（F=1.518和1.777，P=0.00042和0.00032），72 h時，5 μmol/L薯蕷素對細胞增殖的抑制率達到80%，薯蕷素處理組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

為進一步證實薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌的抑制作用，筆者采用軟瓊脂克隆形成實驗檢測薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌克隆形成能力的影響。與MTS結(jié)果一致的是，薯蕷素呈劑量依賴性抑制TSCCa和TCa8113細胞克隆的形成，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.094和21.341，均P=0.000）。5 μmol/L薯蕷素幾乎完全阻斷這2株細胞的克隆形成（P＜0.05）。見圖2。

圖1 薯蕷素對TSCCa和TCa8113細胞增殖的影響

圖2 薯蕷素對細胞停泊非依賴生長的影響

2.2 薯蕷素對有氧糖酵解的影響

對薯蕷素處理前后口腔鱗狀細胞癌葡萄糖攝取能力的檢測發(fā)現(xiàn)，薯蕷素抑制TSCCa和TCa8113細胞對葡萄糖的攝取，該抑制作用具有劑量依賴性。與對照組比較，5 μmol/L薯蕷素下調(diào)了TSCCa細胞65%和TCA8113細胞75%的葡萄糖攝取效率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.866和3.874，P=0.001和0.000）。且這2株細胞的乳酸生成也下調(diào)。5 μmol/L薯蕷素抑制TSCCa細胞近50%和TCa8113近70%的乳酸生成量，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.246和2.234，均P=0.000）。見圖 3。

薯蕷素劑量依賴性抑制TSCCa和TCa8113細胞內(nèi)ATP水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.987和2.194，P=0.001和0.000）。見圖4。

2.3 薯蕷素對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut1和己糖激酶HK2表達的影響

薯蕷素抑制Glut1和HK2蛋白的表達，并不能抑制PFK和PKM2蛋白的表達。見圖5。

2.4 薯蕷素對凋亡相關(guān)分子活化的影響

圖3 薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌糖酵解的影響

圖4 薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌ATP水平的影響

圖5 薯蕷素對Glut1和HK2表達的影響

免疫印跡結(jié)果表明，薯蕷素抑制HK2表達的同時，促進凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切活化。低濃度薯蕷素只能輕微抑制HK2的表達，Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切體活化并不明顯。隨著濃度升高，5 μmol/L薯蕷素能促進Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切體表達。見圖6。

2.5 過表達HK2對薯蕷素誘導(dǎo)細胞凋亡的影響

圖6 薯蕷素對口腔鱗狀細胞癌PARP、Caspase-9和Caspase-3剪切體形成的影響

圖7 過表達HK2對薯蕷素誘導(dǎo)細胞凋亡的影響

與前期結(jié)果一致的是，2 μmol/L薯蕷素能促進Caspase-3和PARP剪切體的表達上調(diào)。過表達HK2后，能抑制薯蕷素誘導(dǎo)的Caspase-3和PARP剪切體表達。見圖7。

3 討論

有氧糖酵解異常是腫瘤細胞重要生物學(xué)特征之一。研究發(fā)現(xiàn)，即使在供氧充足的情況下，腫瘤細胞仍傾向于利用有氧糖酵解的方式將葡萄糖分子不完全氧化生產(chǎn)乳酸來為細胞供能，該現(xiàn)象被稱為“溫伯格效應(yīng)”[7]。有氧糖酵解不僅能為腫瘤細胞提供充足的能量供給，其葡萄糖不完全氧化所生產(chǎn)的中間產(chǎn)物更為快速增殖的腫瘤細胞提供了生物大分子合成所必需的原料。己糖激酶HK2作為催化葡萄糖向葡萄糖6磷酸轉(zhuǎn)化的蛋白激酶，也是糖酵解過程中第一個限速酶。目前共發(fā)現(xiàn)4種己糖激酶亞型，包括HK1、HK2、HK3和HK4，但只有HK2被證明在多種人腫瘤細胞中異常高表達[8]。HK2已被證實在人肝癌、肺癌、乳腺癌和食管癌等多種腫瘤內(nèi)高表達，HK2過表達不僅滿足腫瘤細胞快速增殖而對能量的需求，更促進腫瘤細胞的放化療耐受及死亡逃逸，腫瘤組織內(nèi)高表達HK2提示著預(yù)后不良[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物薯蕷素能抑制口腔鱗狀細胞癌TSCCa和TCa8113細胞的增殖及克隆形成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷素對TSCCa和TCa8113細胞的抑制作用與其下調(diào)腫瘤細胞的糖酵解及HK2的表達有關(guān)。雖然薯蕷素在胞內(nèi)具有多個潛在的分子靶點，如抑制腫瘤相關(guān)蛋白激酶的活化，下調(diào)腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的入核等，但薯蕷素對腫瘤細胞代謝的影響還未見研究報道。本研究首次證實，薯蕷素可以通過下調(diào)HK2表達及有氧糖酵解而抑制口腔鱗狀細胞癌。該結(jié)果提示，靶向抑制HK2的表達/活性，或抑制HK2介導(dǎo)的有氧糖酵解可能為口腔鱗狀細胞癌的臨床治療提供新的藥物作用靶點或開創(chuàng)新的腫瘤診療手段。

研究表明，HK2作為線粒體外膜表達蛋白，在控制線粒體電勢穩(wěn)定性和細胞凋亡方面具有重要的生物學(xué)功能[11]。異常高表達HK2促進腫瘤細胞對不良環(huán)境因素的抵抗及細胞死亡信號的相對不敏感。共同靶向HK2介導(dǎo)的有氧糖酵解和細胞自噬促進前列腺癌細胞的死亡[12]。HK2在線粒體外膜通過與電壓依賴性陰離子通道VDAC相互結(jié)合而穩(wěn)定線粒體電勢。抑制HK2的線粒體表達能有效促進非小細胞性肺癌的凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷素下調(diào)HK2的表達，并誘導(dǎo)TSCCa和Tca8113細胞的凋亡。進一步研究表明，薯蕷素誘導(dǎo)的細胞凋亡是HK2表達下調(diào)依賴的，過表達HK2有效抑制薯蕷素誘導(dǎo)的細胞凋亡。本結(jié)果提示，HK2對促進口腔鱗狀細胞癌的存活具有重要的作用，薯蕷素誘導(dǎo)的口腔鱗狀癌細胞死亡是否與HK2表達下調(diào)而導(dǎo)致的線粒體電勢紊亂有關(guān)還有待進一步研究證實。

靶向抑制有氧糖酵解或糖酵解的關(guān)鍵限速酶對促進腫瘤細胞的死亡或放化療增敏具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種天然產(chǎn)物可以通過抑制腫瘤細胞內(nèi)HK2的表達及下調(diào)有氧糖酵解而發(fā)揮其抗腫瘤功能。如白藜蘆醇、魚藤素通過抑制HK2而促進非小細胞性肺癌凋亡等[13-14]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能抑制HK2的表達并促進口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡[15]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示HK2高表達或上調(diào)有氧糖酵解可能對口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。本研究不僅豐富了小分子化合物薯蕷素抗腫瘤的新機制，更為靶向抑制HK2或有氧糖酵解的口腔鱗狀細胞癌臨床治療提供了前期的研究基礎(chǔ)。