季宏更 鄭惠華 全衛(wèi)豐* 蔣 益 劉廣建 薛 璟 汪 潔

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無(wú)錫214063；2江蘇?。ㄌK微）菌物工程技術(shù)研究中心，江蘇無(wú)錫214063；3江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通216009）

灰樹(shù)花屬于擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱，非褶菌目，多孔菌科，樹(shù)花屬中的一種大型真菌[1]，又名貝葉多孔菌，舞茸?；覙?shù)花多糖是灰樹(shù)花的主要功能性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用[2]，有著重要的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值。Ohno等采取液體深層培養(yǎng)的方法生產(chǎn)灰樹(shù)花多糖，并對(duì)其進(jìn)行分離及成分研究，證明其與天然來(lái)源的灰樹(shù)花多糖具有相似的單糖組成和結(jié)構(gòu)[3，4]，灰樹(shù)花多糖根據(jù)來(lái)源的不同又可分為胞內(nèi)多糖和胞外多糖，二者均具有類(lèi)似的生物活性，國(guó)內(nèi)外的研究實(shí)踐表明液體發(fā)酵法生產(chǎn)提取制備灰樹(shù)花多糖是實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑和方法。目前真菌多糖的提取方法有水提醇沉法、酸堿提取法等，水提醇沉法具有對(duì)環(huán)境友好、提取工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用較多的方法，但其提取效率有待于進(jìn)一步提高。近年來(lái)也出現(xiàn)了利用超聲輔助、微波輔助、蒸汽爆破法以及酶法等進(jìn)行真菌多糖的輔助提取，取得了一定的效果，均是通過(guò)一定的方法破壞細(xì)胞和細(xì)胞壁，促進(jìn)目標(biāo)物的溶出。超聲提取利用超聲產(chǎn)生的“空穴作用”破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞內(nèi)溶物的穿透能力；微波提取法是通過(guò)微波傳遞能量到細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)壓力增大，細(xì)胞壁破裂從而形成微孔，加速細(xì)胞內(nèi)容物的溶出；而蒸汽爆破法是利用蒸汽受壓縮而后突然減壓時(shí)釋放出的強(qiáng)大力量沖破物料細(xì)胞壁，撕裂組織，從而提高物質(zhì)的提取效率。筆者對(duì)灰樹(shù)花液體發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究和優(yōu)化，旨在提高灰樹(shù)花多糖的產(chǎn)率；同時(shí)綜合比較了多種不同的輔助提取方法對(duì)于灰樹(shù)花多糖提取的效果，以期在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上優(yōu)選出一種更為理想的多糖提取工藝，提升灰樹(shù)花粗多糖的提取效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

①供試菌株：灰樹(shù)花菌株，編號(hào)AHSWF-001，為自有誘變菌株。②儀器與設(shè)備：旋轉(zhuǎn)式搖床（HZ-81），100 L發(fā)酵罐及配套裝備，循環(huán)水式多用真空泵SHB-ⅢA，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Alpha-1500），SG2pH計(jì)（梅特勒托利多），超聲波清洗儀K45200DE，微波儀（KJ25B-A），高壓蒸汽爆破儀（自制）。③培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基為葡萄糖2%，馬鈴薯（去皮煮沸過(guò)濾取汁）2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂2%，水1000 mL，pH自然。種子液培養(yǎng)基為豆餅粉1.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，加水1000 mL，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰樹(shù)花液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.1.1 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)確定適宜的碳源和氮源。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，加水1000 mL，pH自然。

碳源的優(yōu)選：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2%質(zhì)量比的供試碳源（蔗糖、玉米粉、葡萄糖和可溶性淀粉），考察添加不同的碳源對(duì)灰樹(shù)花液體發(fā)酵菌絲生物產(chǎn)量的影響；

氮源的優(yōu)選：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%質(zhì)量的供試氮源（豆餅粉，麩皮，蛋白胨，酵母膏，尿素）（豆餅粉、玉米粉過(guò)80目篩，99℃浸提1 h，麩皮99℃浸提1 h），考察添加不同的氮源對(duì)灰樹(shù)花液體發(fā)酵菌絲生物產(chǎn)量的影響。

上述試驗(yàn)每個(gè)處理作三個(gè)平行。液體種制作：PDA斜面菌種活化后，接種于種子液中，140 r/min，26℃培養(yǎng)10 d（下同）。發(fā)酵條件：灰樹(shù)花種子液按5%接種量接入含不同碳、氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基中，26℃，140 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)6 d，抽濾，65℃烘干，稱(chēng)量菌絲體干重即為菌絲體生物量。

1.2.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)中最適碳源、氮源以及葡萄糖和接種量為四因素，按L9（34）設(shè)計(jì)4因素、3水平正交試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)選，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成9個(gè)配方，見(jiàn)表2。

1.2.1.3 100 L發(fā)酵罐中試試驗(yàn)

按優(yōu)化后的配方配制培養(yǎng)基，裝液量60 L，以10%接種量接種種子液，攪拌速度140 r/min，通氣比1∶0.5（體積比），培養(yǎng)約120 h后，以還原糖不再下降、pH出現(xiàn)回升時(shí)終止發(fā)酵，放罐。測(cè)定菌絲體生物量和多糖總產(chǎn)率。

1.2.2 灰樹(shù)花多糖的提取

菌絲體粗多糖提取試驗(yàn)流程：菌絲體烘干粉碎篩→加水→輔助提取→水浴提取→過(guò)濾→濾液濃縮→醇沉→干燥→提取物

發(fā)酵液粗多糖提取流程：發(fā)酵液→濃縮→醇沉→干燥→提取物

水提法提取多糖的試驗(yàn)：樣品為烘干后的灰樹(shù)花菌絲體，粉碎過(guò)80目篩，以料水比、提取時(shí)間、提取溫度為不同的因素。因素水平設(shè)置如下：料水比為1∶10，1∶20，1∶30；提取時(shí)間為0.5 h，1 h，1.5 h；提取溫度為80℃，90℃，100℃。按照不同的處理提取多糖，提取液抽濾，濃縮至約1/10體積，4倍體積無(wú)水乙醇4℃醇沉，沉淀干燥，得提取物。測(cè)定樣品中的粗多糖含量。

輔助法提取多糖的試驗(yàn)：以不同的輔助方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，然后以水提法進(jìn)行粗多糖的提取。比較不同的輔助方法所對(duì)應(yīng)多糖提取率，同時(shí)每個(gè)方法中選取不同的因素水平，每個(gè)水平作三個(gè)平行試驗(yàn)，考察在上述試驗(yàn)中不同的因素水平處理對(duì)多糖提取結(jié)果的影響。

超聲輔助提?。簶悠泛娓煞鬯楹?，45℃超聲提取10 min，20 min，30 min。料水比設(shè)置1∶10，1∶20，1∶30，而后100℃沸水浴提取1 h，合并濾液濃縮至1/10體積，加入4倍體積無(wú)水乙醇沉淀，4℃靜置，3000 r/min離心15 min，取沉淀干燥，得提取物。計(jì)算樣品中的粗多糖含量。試驗(yàn)基準(zhǔn)條件為料水比1∶20，超聲提取20 min。

微波輔助提取：樣品烘干粉碎，加水，料水比1∶20，850 W，微波加熱 5 min，10 min，15 min，然后按上述水提法進(jìn)行粗多糖的提取，測(cè)定樣品中粗多糖含量。

爆破提取法：樣品烘干粉碎，加水，料液比1∶20，通蒸汽升壓，壓力設(shè)置為 0.8 MPa，1.2 MPa，1.6 MPa，維壓時(shí)間選擇5 min，10 min，15 min。迅速放壓后得爆破渣和爆破液，混合后以水提法進(jìn)行粗多糖的提取，得提取物。測(cè)定樣品中的粗多糖含量。試驗(yàn)基準(zhǔn)條件為壓力1.2 MPa，維壓時(shí)間20 min。

1.2.3 計(jì)算方法

菌絲生物量（g/100 mL）：液體發(fā)酵后混合液抽濾，取菌絲體105℃烘干至恒重，稱(chēng)重。

粗多糖的提取率（%）：采用一定的提取方法進(jìn)行多糖提取后測(cè)算出樣品中粗多糖的含量，試驗(yàn)中粗多糖的含量測(cè)定均采用硫酸蒽酮法[5]。

粗多糖提取收率（%）=提取物中的多糖質(zhì)量/樣品中多糖質(zhì)量×100

粗多糖的總產(chǎn)率（g/L）=菌絲體生物量（g/L）×菌絲體中粗多糖的含量（%）+發(fā)酵液中粗多糖的含量（g/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見(jiàn)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2%玉米粉為碳源，搖瓶液體發(fā)酵后灰樹(shù)花菌絲體生物量同比最高，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%豆餅粉為氮源時(shí)，搖瓶液體發(fā)酵菌絲體生物量同比最高，因此選擇玉米粉和豆餅粉作為優(yōu)選后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源。

表1 不同碳氮源對(duì)灰樹(shù)花液體發(fā)酵菌絲體生物量的影響

2.1.2 液體發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

葡萄糖作為可快速利用的速效碳源，對(duì)菌絲體前期的生長(zhǎng)具有重要作用，接種量直接影響液體發(fā)酵的時(shí)間和生物量，因此選擇豆餅粉、玉米粉、葡萄糖的添加量和接種量的作為正交試驗(yàn)的四因素，以四因素三水平進(jìn)行如下正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表2 正交試驗(yàn)因素及水平

由表3可見(jiàn)，對(duì)試驗(yàn)中液體發(fā)酵菌絲體生物量影響最大的因素為C接種量（對(duì)應(yīng)的R值最高），由表3中K值顯示試驗(yàn)最佳組合A1B3C3D2，即豆餅粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，接種量10%。因此，搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)中篩選到的最佳培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件為，豆餅粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，水 1000 mL，pH 自然。發(fā)酵條件：26℃，140 r/min搖床培養(yǎng)10 d。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，灰樹(shù)花搖瓶液體發(fā)酵生物量為1.210 g/100 mL，此時(shí)菌絲體多糖的產(chǎn)率達(dá)到0.78 g/L。

2.2 灰樹(shù)花粗多糖的提取結(jié)果

水提法多糖提取試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

采用單因素試驗(yàn)方法。由表4可見(jiàn)，水提法提取多糖適宜的料水比為1∶20，此時(shí)對(duì)應(yīng)的粗多糖提取率最高，為4.46%；在提取時(shí)間0.5～1.5 h，粗多糖提取率總體隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增長(zhǎng)迅速，而后增長(zhǎng)緩慢的趨勢(shì)，適宜的提取時(shí)間為1.5 h；粗多糖提取率隨提取溫度的升高呈上升趨勢(shì)，在100℃時(shí)相應(yīng)的粗多糖含量最高。因此，試驗(yàn)確定的適宜的提取參數(shù)為料水比1∶20，提取時(shí)間1.5 h，100℃提取。

表3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)

由表5可見(jiàn)，超聲、微波和爆破輔助提取法對(duì)于提高灰樹(shù)花多糖提取率均有一定的促進(jìn)作用，其中超聲輔助提取的效果最好，其次為爆破輔助提取法。在超聲輔助提取時(shí)，提取時(shí)間選擇30 min左右效果較好，此時(shí)粗多糖提取率達(dá)到4.81%，爆破輔助提取時(shí)壓力選擇為1.5 MPa，維壓時(shí)間30 min效果較好，微波加熱時(shí)間選擇在15 min時(shí)效果較好。超聲輔助提取30 min時(shí)粗多糖提取率比對(duì)照CK（單一水提法）提高了9.32%。

表4 水提法提取灰樹(shù)花多糖試驗(yàn)結(jié)果

表5 多種輔助方法多糖提取的比較試驗(yàn)

3 小結(jié)與討論

以100 L發(fā)酵罐進(jìn)行灰樹(shù)花液體發(fā)酵中試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用試驗(yàn)優(yōu)選出的培養(yǎng)基配方：豆餅粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，水1000 mL，pH自然。接種量10%，攪拌速度140 r/min，26℃，培養(yǎng)120 h，灰樹(shù)花菌絲體干重達(dá)到21.97 g/L，灰樹(shù)花總多糖的產(chǎn)率達(dá)到3.29 g/L。

在灰樹(shù)花液體發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，灰樹(shù)花多糖的產(chǎn)率及質(zhì)量受菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和工藝的影響較大，后續(xù)需要繼續(xù)進(jìn)行放大試驗(yàn)和多糖產(chǎn)品分離純化、結(jié)構(gòu)功效的研究，以期實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明超聲輔助水提法，適合應(yīng)用于灰樹(shù)花多糖的提取，效果較好。具體工藝和參數(shù)為：菌絲體粉碎后過(guò)80目篩，加水，料水比1∶20，45℃超聲提取30 min，而后100℃提取1.5 h，提取液過(guò)濾，濃縮至1/10體積，4倍體積無(wú)水乙醇沉淀，干燥得提取物。經(jīng)測(cè)定灰樹(shù)花多糖的提取率達(dá)到85%，提取物的多糖純度為65%，蛋白肽的含量為30%左右，因蛋白肽具有較高的藥理保健作用，在試驗(yàn)中未進(jìn)行蛋白肽的去除。

近年來(lái)有不同研究者先后利用微波法、酶法、蒸汽爆破法等方法進(jìn)行真菌多糖的輔助提取，各種方法各有優(yōu)勢(shì)，對(duì)多糖的提取均起到了一定的促進(jìn)作用。多糖提取工藝的設(shè)計(jì)優(yōu)化，要綜合考量平衡提取效率、生產(chǎn)能耗成本、工藝設(shè)備簡(jiǎn)便及可操作性等因素，以提高提取技術(shù)方法的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。超聲輔助灰樹(shù)花多糖提取工藝具有提取效率較高、設(shè)備較為簡(jiǎn)便、提取時(shí)間較短以及能耗較低等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)適合進(jìn)行推廣應(yīng)用。