劉 諾，王真真，陳乃宏

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所&神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100050)

Cx43蛋白是構(gòu)成縫隙連接(gap junction，GJ)的縫隙連接蛋白(connexin，Cx)家族主要成員之一。通過(guò)GJ實(shí)現(xiàn)物質(zhì)能量交換，有效維持了體內(nèi)的生理生化穩(wěn)態(tài)。本文就GJ的結(jié)構(gòu)與功能，Cx43蛋白的編碼基因、結(jié)構(gòu)解析、合成、細(xì)胞膜定位、調(diào)節(jié)和在人體中所發(fā)揮的生理功能，以及其在相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病進(jìn)程中所扮演的角色等方面的研究進(jìn)行綜述。

1 GJ的結(jié)構(gòu)及功能

GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊是最直接和最主要的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)方式，可以快速且可逆地達(dá)成相鄰細(xì)胞對(duì)外界所傳達(dá)信號(hào)的共同反應(yīng)。GJ的結(jié)構(gòu)組成和功能發(fā)揮的基本元件是縫隙連接蛋白Cx，其連接子(Connexon)即半通道由6個(gè)Cx亞基環(huán)繞中間孔道(直徑1.5～2.0 nm)橫跨細(xì)胞膜形成 ，最后中央親水性孔道對(duì)接形成GJ。GJ允許小分子及離子通過(guò)(相對(duì)分子質(zhì)量小于1.2×103，如ATP、cAMP、鈣離子等)[1]，從而通過(guò)其介導(dǎo)的縫隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本生命過(guò)程，維持穩(wěn)態(tài)平衡。GJ通道的開(kāi)放關(guān)閉和通透性受多種因素調(diào)控，如pH值、鈣離子濃度、膜電位、原癌基因的激活和抑制、生長(zhǎng)因子和蛋白激酶數(shù)量的改變等[2]。已知的GJ功能包括：①傳遞信號(hào)；②緩和有害物質(zhì)毒性；③介導(dǎo)受損細(xì)胞的修復(fù)；④參與代謝；⑥參與細(xì)胞的黏附及運(yùn)動(dòng)[3]。

2 Cx43的編碼基因和結(jié)構(gòu)解析

人類Cx家族由同一基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)，高度相關(guān)。其中，Cx43是由平均長(zhǎng)度為923 bp的3條DNA鏈編碼，作為沒(méi)有經(jīng)過(guò)突變的抑癌基因存在。人類組織中的Cx43編碼基因位于2個(gè)位點(diǎn)：一個(gè)功能基因存在于第6對(duì)染色體上，一個(gè)假基因存在于第5對(duì)染色體上。部分常染色體隱性突變是由于第6對(duì)染色體上功能基因的3’末端被插入1個(gè)堿基。Cx43基因的增強(qiáng)子包括3個(gè)部分：①轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)前的TATA框(-25, -18)；②促進(jìn)區(qū)(-64, -55)；③抑制區(qū)(-93, -87)。Cx43在眾多器官中發(fā)揮作用，如腦、皮膚、心臟，分布廣泛[4]。Cx43有3個(gè)膜內(nèi)部分、2個(gè)膜外部分和4個(gè)親油跨膜區(qū)。其中，氨基端、羧基端及細(xì)胞質(zhì)環(huán)存在于膜內(nèi)，而便于識(shí)別和對(duì)接相鄰細(xì)胞的部分則存在于膜外。單個(gè)Cx43可以聚合形成六聚體連接子，幾個(gè)連接子在經(jīng)過(guò)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)細(xì)胞膜上之后，聚集成為GJ斑，其數(shù)目與細(xì)胞間通訊的順暢性呈正相關(guān)。而蛋白羧基端的磷酸化會(huì)影響其功能的發(fā)揮，這種磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸殘基上。

3 Cx43蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯和細(xì)胞膜定位

Cx43是按照傳統(tǒng)的途徑合成的，即粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體以核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄得來(lái)的mRNA為模板，翻譯成蛋白質(zhì)，后經(jīng)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基復(fù)合體，聚合成連接子，并進(jìn)行相應(yīng)的翻譯后修飾[5]。成熟的半通道需到達(dá)細(xì)胞膜上后，與另一個(gè)細(xì)胞的半通道進(jìn)行對(duì)接，才能參與到細(xì)胞與細(xì)胞間的生理進(jìn)程中。

關(guān)于合成的半通道定位于細(xì)胞膜的具體機(jī)制，有研究顯示，Cx43從高爾基體運(yùn)送到細(xì)胞間連接斑處是由微管蛋白完成的，β-catenin、p150、N-cadherin也在此過(guò)程發(fā)揮重要作用。然而，具體機(jī)制不是很清楚，可能與Cx43羧基末端的特定功能位點(diǎn)有關(guān)。另外，肌動(dòng)蛋白的數(shù)量與Cx43運(yùn)輸至細(xì)胞膜的數(shù)量呈正相關(guān)，研究表明，敲除β-actin基因會(huì)影響GJ的數(shù)量?？梢?jiàn)，多種蛋白共同參與到Cx43的轉(zhuǎn)運(yùn)定位過(guò)程，其中某些蛋白的分布或功能發(fā)生異常，可能是Cx43相關(guān)疾病的致病原因。

4 Cx43蛋白的功能調(diào)節(jié)

研究表明，Cx43的功能調(diào)節(jié)位點(diǎn)大多數(shù)位于羧基端[6-7]。Cx43羧基末端(C)的磷酸化和去磷酸化主要通過(guò)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及Src家族的酪氨酸激酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而改變Cx43縫隙連接效應(yīng)，由此介導(dǎo)激素、炎癥遞質(zhì)和生長(zhǎng)因子的生理功能[8]。研究發(fā)現(xiàn)，不同途徑通過(guò)磷酸化羧基端不同位點(diǎn)，影響GJ的通訊功能，PKC途徑作用于368和262位點(diǎn)，MAPK途徑作用于282、279和252位點(diǎn)[9]。酪氨酸激酶途徑則通過(guò)使Cx43蛋白的247位點(diǎn)和268位點(diǎn)磷酸化，阻礙GJ的通訊功能，Cx43的268位點(diǎn)發(fā)生磷酸化是由于酪氨酸激酶作用于Cx43的C末端，并與其SH3(Src同源結(jié)構(gòu)域)結(jié)合，這種磷酸化又可以提供潛在的酪氨酸激酶SH2結(jié)合位點(diǎn)，使得Cx43的247位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而調(diào)節(jié)通道的關(guān)閉。

在Cx43結(jié)合蛋白中，緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)對(duì)GJ功能有著重要影響，這是通過(guò)與Cx43蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，ZO-1會(huì)影響GJ斑的形成和功能，這是通過(guò)與羧基端末端殘基結(jié)合，促進(jìn)GJ開(kāi)放實(shí)現(xiàn)的。ZO-1還能調(diào)節(jié)半通道開(kāi)放，這是因?yàn)闆](méi)有參與到GJ形成的Cx因其作用而聚集。結(jié)合蛋白中的c-Src與磷酸化的Cx43結(jié)合，可以關(guān)閉細(xì)胞間GJ通道[10]。另外，通過(guò)FRET和Co-IP研究顯示，調(diào)節(jié)蛋白有利于GJ發(fā)揮正常生理功能，其機(jī)制是與細(xì)胞骨架F-actin結(jié)合，并作用于Cx43羧基末端[11]。

5 縫隙連接蛋白Cx43的生理功能及其參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理進(jìn)程的機(jī)制

神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞，如神經(jīng)元、室管膜細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它們的物質(zhì)代謝和同種細(xì)胞之間的信息傳導(dǎo)是依靠GJ完成的。研究發(fā)現(xiàn),室管膜細(xì)胞的鈣離子外流與半通道的開(kāi)放密切相關(guān)[12]。神經(jīng)系統(tǒng)GJ和半通道的主要構(gòu)成蛋白是Cx43蛋白，Cx43蛋白對(duì)于其功能的發(fā)揮有著重要的調(diào)節(jié)作用。

神經(jīng)元的興奮同步化和過(guò)度興奮抑制與GJ有關(guān)。Cx43蛋白調(diào)節(jié)GJ通道，直接參與神經(jīng)元電突觸聯(lián)系中細(xì)胞間動(dòng)作電位的傳導(dǎo)，從而使兩個(gè)相鄰神經(jīng)元的興奮間隔縮短到可忽略不計(jì)的程度[13]。Cx43蛋白還通過(guò)插入突觸后膜電位，抑制過(guò)度興奮，從而保證了神經(jīng)元外的環(huán)境穩(wěn)態(tài)和突觸功能的穩(wěn)定[14]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞間的電信號(hào)傳導(dǎo)頻率很高，主要與Cx43蛋白構(gòu)成的GJ密切相關(guān)。離子交換即細(xì)胞偶聯(lián)，需要縫隙連接蛋白改變構(gòu)象來(lái)完成，由Cx43蛋白和Cx30蛋白參與，其中比較重要的過(guò)程包括由G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)和調(diào)節(jié)的Cx43蛋白磷酸化和脫磷酸化，脫磷酸化同樣離不開(kāi)磷酸酶的調(diào)節(jié)，而且需要人內(nèi)皮素1(endothelin 1，ET-1)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的介導(dǎo)[15]。有關(guān)研究顯示，Cx43介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸鹽的釋放，表現(xiàn)為其受體被拮抗時(shí)，谷氨酸鹽外流中止[16]。除了介導(dǎo)GJ的相關(guān)功能之外，Cx43高表達(dá)還可以保護(hù)膠質(zhì)細(xì)胞免受凋亡信號(hào)的影響，GJ的抑制劑不會(huì)影響這種作用。

目前，Cx43蛋白相關(guān)的病理機(jī)制主要出現(xiàn)在缺血/再灌注腦損傷、創(chuàng)傷性腦損傷以及抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中。

5.1Cx43蛋白與大腦缺血/再灌注損傷缺血/再灌注損傷的形成與細(xì)胞間偶聯(lián)密切相關(guān)，代謝偶聯(lián)和信號(hào)傳導(dǎo)可以將有害物質(zhì)和凋亡信號(hào)迅速傳導(dǎo)到缺血病灶周邊細(xì)胞。大部分研究者認(rèn)為，GJ介導(dǎo)大腦缺血/再灌注時(shí)，缺氧壞死產(chǎn)生物質(zhì)和凋亡信號(hào)的傳遞，造成缺血周?chē)鷧^(qū)域的繼發(fā)損害，導(dǎo)致大量神經(jīng)元的不可逆損傷。研究發(fā)現(xiàn)，一系列海馬區(qū)域缺血/再灌注模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞GJ的數(shù)量越多、密度越大，神經(jīng)元的損害就越嚴(yán)重，而造模并應(yīng)用GJ拮抗劑48 h后，細(xì)胞死亡數(shù)目與單純?cè)炷＝M相比明顯減少。另有研究者認(rèn)為，Cx43蛋白與缺血/再灌注損傷后的細(xì)胞生存有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，若抑制半通道的作用，損傷后的病灶周邊區(qū)域細(xì)胞生存情況明顯變差，而吸入氧氣所帶來(lái)的Cx43表達(dá)增加，則有利于損傷修復(fù)[17]，而且，缺血時(shí)，Cx43高表達(dá)刺激半通道的進(jìn)一步開(kāi)放帶來(lái)的ATP分解代謝增加，會(huì)產(chǎn)生有神經(jīng)保護(hù)作用的腺苷，這都可以證明Cx43同樣具有保護(hù)缺血/再灌注損傷的作用。因此，合理控制Cx43的表達(dá)既可以緩解缺血/再灌注損傷的擴(kuò)散，又能促進(jìn)腦組織修復(fù)的進(jìn)行，可以作為臨床治療的新靶點(diǎn)。

5.2Cx43蛋白與創(chuàng)傷性腦損傷研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷的各個(gè)病理階段中，與無(wú)損傷對(duì)照組相比，Cx43均表現(xiàn)出高表達(dá)。早期，一方面Cx43表達(dá)增加帶來(lái)的GJ功能增強(qiáng)，會(huì)加速缺氧壞死產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的擴(kuò)散，使病變部位周邊細(xì)胞凋亡增多，擴(kuò)大病變范圍；另一方面，由于半通道的開(kāi)放增多，谷氨酸鹽大量釋放，發(fā)揮其神經(jīng)興奮性毒性作用，帶來(lái)腦水腫的進(jìn)一步惡化[18]。后期，高表達(dá)的Cx43會(huì)促進(jìn)GJ介導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，減輕損傷程度。

5.3Cx43蛋白與抑郁癥越來(lái)越多的證據(jù)顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者的尸檢結(jié)果中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目減少，形態(tài)發(fā)生了明顯改變[19]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦中形成網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)GJ進(jìn)行信息交流[20]。公認(rèn)的研究結(jié)果是，Cx43蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞中大量合成。Sun等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，前邊緣皮層注射GJ抑制劑甘珀酸和Cx43模擬肽段Gap26、Gap27，使大鼠表現(xiàn)出抑郁的典型癥狀——快感缺失，證明星形膠質(zhì)細(xì)胞GJ的功能障礙，在抑郁癥的發(fā)病中起著重要作用，正常Cx43蛋白的存在對(duì)于GJ信息交流功能的正常行使必不可少。該項(xiàng)研究的Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)典抑郁模型——慢性不可預(yù)知性應(yīng)激使Cx43的mRNA含量和蛋白含量均明顯下降，而經(jīng)典抗抑郁藥，如氟西汀和度洛西汀可以逆轉(zhuǎn)這種改變，進(jìn)一步證明了Cx43蛋白減少在抑郁癥發(fā)病中的意義，以及5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)類藥物發(fā)揮抗抑郁作用的機(jī)制中包含恢復(fù)Cx43蛋白的正常水平[21]。

5.4Cx43蛋白與癲癇Jordan等[22]對(duì)切除的癲癇患者發(fā)病相關(guān)腦區(qū)組織進(jìn)行了Northern印跡分析，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接蛋白Cx43 mRNA表達(dá)量明顯升高。這可能是因?yàn)榘l(fā)病部位神經(jīng)元過(guò)度同步化放電，導(dǎo)致胞外K+含量大幅度增加。為了盡快清除過(guò)多的K+、恢復(fù)正常的內(nèi)環(huán)境，Cx43蛋白代償性表達(dá)上升，增加的GJ數(shù)量使清除面積增大，從而有助于神經(jīng)元周?chē)h(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。這表明Cx43蛋白表達(dá)升高與癲癇發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

5.5Cx43蛋白與神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Cx43蛋白表達(dá)水平與大多數(shù)腫瘤相似，呈較低水平，明顯低于正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞[23]。同時(shí)，正常膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行癌基因轉(zhuǎn)染或使用致癌劑誘導(dǎo)后，Cx43蛋白表達(dá)水平明顯降低。另有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖速度在經(jīng)過(guò)Cx43基因轉(zhuǎn)染后明顯降低，很可能是因?yàn)镚J形成增加[24]。這表明Cx43蛋白表達(dá)促進(jìn)GJ構(gòu)建，可以抑制腫瘤的形成和發(fā)展。

6 結(jié)語(yǔ)

縫隙連接蛋白Cx43是構(gòu)成GJ的重要成分之一，GJ介導(dǎo)物質(zhì)能量交換，有效維持了體內(nèi)的生理生化穩(wěn)態(tài)。神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間分布著豐富的GJ和半通道，Cx43蛋白作為星形膠質(zhì)細(xì)胞GJ重要成分之一，其表達(dá)異常與大腦缺血/再灌注損傷、創(chuàng)傷性腦損傷、抑郁癥、癲癇、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病密切相關(guān)。對(duì)Cx43蛋白的編碼基因、結(jié)構(gòu)、合成、細(xì)胞膜定位、功能調(diào)節(jié)等的深入研究，將有助于我們尋找相關(guān)疾病的新的藥物治療靶點(diǎn)，為新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。