張啟德，葛蓉，王建寧

腫瘤免疫治療已成為繼手術(shù)、放化療治療后第4大腫瘤療法之一[1]。目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，包括CTLA-4、PD-1及其配體PD-L1抑制劑。惡性腫瘤及其微環(huán)境中過(guò)度表達(dá)的程序性死亡配體-1(programmed death ligands 1，PD-L1)與程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)結(jié)合，激活下游通路，下調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤逃逸人體免疫監(jiān)視及殺傷，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。PD-1及PD-L1在多種胃腸道惡性腫瘤中上調(diào)，阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路為腫瘤免疫治療提供可能[2]。胃癌作為我國(guó)常見惡性腫瘤之一，其預(yù)后也與細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)功能缺失有關(guān)[3]。目前已發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)基因有多種，錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1參與DNA錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程，是其中關(guān)鍵蛋白[4]。因此了解胃癌患者PD-1、PD-L1和錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，可能為臨床選擇應(yīng)用PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療優(yōu)勢(shì)人群提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集南京市江寧醫(yī)院2015年1月至2016年12月，胃癌根治術(shù)后組織學(xué)證實(shí)為胃癌的石蠟標(biāo)本76例。所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋，制成5 μm切片、HE染色后，由兩位具有高級(jí)職稱的病理醫(yī)師進(jìn)行病理學(xué)診斷。

1.2 免疫組化法檢測(cè)PD-L1、PD-1和錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1蛋白表達(dá) 免疫組化過(guò)程按照PV-9000試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化、3% H2O2避光孵育10 min，PBS緩沖液清洗3次，加入一抗PD-L1、PD-1、hMSH2或hMLH1(均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司)，1∶100稀釋，PBS作空白對(duì)照；4 ℃冰箱過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫60 min，應(yīng)用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 免疫組化標(biāo)本由兩位高級(jí)職稱病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片判定。PD-L1和PD-1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，hMSH2 和hMLH1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，陽(yáng)性染色為黃至棕褐色顆粒。均采用二次計(jì)分法：每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞及其百分比。染色強(qiáng)度分級(jí)：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞密度分級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為3分。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphpadPrism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間差異比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析胃癌組織中PD-L1、PD-1與錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1表達(dá)的相互關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織PD-L1、PD-1、hMSH2、hMLH1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中，PD-L1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為47.37%(36/76)，其表達(dá)與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及脈管癌栓有關(guān)，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期者PD-L1表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ期者(P<0.05)，腫瘤低分化者PD-L1表達(dá)高于中分化及高分化者(P<0.05)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于未轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，而有脈管癌栓者高于無(wú)脈管癌栓者(P<0.05)，見表1。

胃癌組織中，PD-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為39.47%(30/76)，其表達(dá)與各臨床病理特征均無(wú)關(guān)(均P>0.05)。胃癌組織中錯(cuò)配修復(fù)基因hMSH2 表達(dá)陽(yáng)性率為35.53%(27/76)，hMLH1表達(dá)陽(yáng)性率為38.16%(29/76)，兩者表達(dá)均僅與TNM分期相關(guān)，Ⅲ、Ⅳ期表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，見表1。

2.2 胃癌中PD-L1、PD-1與錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法對(duì)PD-L1、PD-1與錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1表達(dá)水平之間的關(guān)系分析顯示，76例標(biāo)本中，PD-L1與hMSH2、hMLH1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(均P<0.05)，而PD-1與PD-L1、hMSH2 、hMLH1蛋白表達(dá)均無(wú)相關(guān)(均P>0.05)，見表2、表3。

表1 胃癌組織PD-L1、PD-1和錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMSH2、hMLH1表達(dá)與腫瘤組織病理的關(guān)系

表2 胃癌組織中PD-L1、PD-1和hMLH1、hMSH2表達(dá)水平的相關(guān)關(guān)系

表3 胃癌組織中PD-L1和PD-1表達(dá)水平的相關(guān)關(guān)系

3 討論

近年來(lái)，免疫治療特別是免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)免疫治療取得較大進(jìn)步，PD-1、PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種進(jìn)展期腫瘤中得到應(yīng)用。PD-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的負(fù)性共刺激信號(hào)分子之一，腫瘤組織中淋巴細(xì)胞，尤其是活化T細(xì)胞均能檢測(cè)到PD-1蛋白表達(dá)。PD-L1與T細(xì)胞表面受體PD-1結(jié)合后，抑制T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞凋亡，最終是機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)降低，引起腫瘤進(jìn)展。然而，PD-1/PD-L1抑制劑在不同腫瘤的應(yīng)用結(jié)果表明，PD-L1在腫瘤或免疫細(xì)胞的表達(dá)雖重要，但并非絕對(duì)的療效預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志[5-6]。更進(jìn)一步研究表明，PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑pembrolizumab可選擇性延長(zhǎng)存在基因錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷的直腸癌患者生存期[7]。錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷常導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)下降，引起細(xì)胞DNA錯(cuò)配無(wú)法修復(fù)，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞惡變產(chǎn)生腫瘤[8]。胃癌組織中，PD-L1與PD-1表達(dá)相關(guān)性尚無(wú)定論。本研究結(jié)果表明，PD-L1與PD-1表達(dá)無(wú)相關(guān)，PD-1表達(dá)與多項(xiàng)臨床病理特征無(wú)相關(guān)，這可能與腫瘤微環(huán)境中存在其他負(fù)向免疫調(diào)節(jié)分子有關(guān)[9]。PD-L1表達(dá)與總生存期有關(guān)，近年來(lái)有研究顯示，PD-L1在腫瘤表達(dá)可作為判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)[10]。本研究結(jié)果顯示，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤組織病理特征相關(guān)，胃癌組織PD-L1表達(dá)與性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無(wú)相關(guān)，與腫瘤分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯相關(guān)，低分化、分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率最高，表明PD-L1在惡性程度較高、預(yù)后較差的腫瘤組織中表達(dá)增高。

Keynote-012研究表明，PD-1抗體Pembrolizumab治療PD-L1陽(yáng)性晚期胃腺癌安全有效，將PD-L1陽(yáng)性作為篩選目標(biāo)，可選擇從PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中獲益的人群[11]。然而研究表明，雖然PD-1抑制劑治療非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤及腎癌客觀反應(yīng)率為6%～17%，疾病穩(wěn)定時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)2年，但PD-1抑制劑在其他組織學(xué)類型，如胃腸腫瘤和膽胰腫瘤的治療作用卻微不足道[12]。這一現(xiàn)象提示，對(duì)于PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑可能存在部分敏感人群，尋找PD-L1以外新的生物標(biāo)志物可更好預(yù)測(cè)其療效。一項(xiàng)PD-1抑制劑前瞻性試驗(yàn)表明，PD-1抑制劑對(duì)于錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷的腸癌能取得良好療效，MMR缺陷腸癌組的客觀緩解率及無(wú)進(jìn)展生存期顯著高于MMR正常腸癌組，包括胃癌在內(nèi)的其他MMR缺陷的腫瘤組客觀緩解率也高達(dá)60%。研究發(fā)現(xiàn)，在MMR缺陷腫瘤組，雖然PD-L1表達(dá)仍顯著，但PD-L1表達(dá)并不與治療反應(yīng)獨(dú)立相關(guān)。提示PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用對(duì)象的選擇需從腫瘤類型向分子特征轉(zhuǎn)變[5]。目前對(duì)MMR缺陷的檢測(cè)僅限于懷疑Lynch綜合征患者或者早期結(jié)腸癌患者，因?yàn)镸MR缺陷常預(yù)示更好預(yù)后，部分腸癌患者可避免輔助化療[13]。研究表明，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)于MMR缺陷腫瘤廣泛有效，后續(xù)臨床中可擴(kuò)大對(duì)MMR缺陷的檢測(cè)范圍。腫瘤組織中錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)或功能下降。本研究中，我們同時(shí)檢測(cè)了腫瘤組織PD-L1及錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程中關(guān)鍵蛋白hMSH1、hMLH2表達(dá)，表明錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期相關(guān)，錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)與PD-L1呈正相關(guān)。這一結(jié)果與上述前瞻性試驗(yàn)不完全一致，可能與樣本量不大且分別從基因和蛋白水平檢測(cè)有關(guān)，后續(xù)研究中，我們需完善基因水平的微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)，以進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，PD-L1表達(dá)與多種胃癌臨床病理特征相關(guān)，隨著胃癌病情發(fā)展及惡性程度增高，PD-L1表達(dá)陽(yáng)性率逐漸升高。PD-L1表達(dá)與錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)相關(guān)，在應(yīng)用PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑時(shí)同時(shí)檢測(cè)PD-L1及錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)，更有利于預(yù)測(cè)藥物抗腫瘤效果。