賈寶珠 ，盧勝洪，方穗戀，鮑金勇，陳子鍵 ，楊公明 ，羅 林

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

賈寶珠，盧勝洪，方穗戀，等. 香蕉皮原花色素的酶解輔助提取及穩(wěn)定性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，45（11）：95-103.

香蕉是世界“四大水果”之一，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植［1］。在我國，香蕉年產(chǎn)量可達(dá)1 000萬t［2］。香蕉因其價(jià)格低、味道好、營養(yǎng)價(jià)值高深受人們喜愛。近年來，香蕉深加工產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，除了鮮食香蕉外，市場上也涌現(xiàn)出了多種香蕉加工制品［3］。作為香蕉深加工的副產(chǎn)物，如若處理不當(dāng)，對(duì)環(huán)境十分不利［4］。香蕉皮占香蕉總重的30%～40%，富含多酚［5-6］、纖維素［7］、果膠［8］、有機(jī)酸［9］、多糖［10］和蛋白質(zhì)［11］等多種活性成分，還含有多種無機(jī)鹽和維生素，Ca、Mg、P、K的含量也相當(dāng)豐富［12］，具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值。原花色素具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基作用［13-14］，被認(rèn)為是一種天然抗氧化活性成分，目前已被廣泛應(yīng)用于保健品、食品及化妝品等領(lǐng)域［15］。香蕉皮中含有大量的纖維素和果膠［16］，復(fù)合植物水解酶可以有效分解構(gòu)成細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的纖維素、半纖維素和果膠，將原花色素從細(xì)胞中釋放出來，從而提高原花色素的提取得率［17-18］。酶解輔助提取法高效、無毒、反應(yīng)條件溫和，已廣泛應(yīng)用于天然活性成分的提?。?9-21］。

本研究采用酶解輔助提取法對(duì)香蕉皮中的原花色素進(jìn)行提取，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在提供一種優(yōu)化的香蕉皮原花色素的提取方法和參數(shù)，為香蕉皮廢棄物的利用提供理論依據(jù)，對(duì)香蕉加工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的生態(tài)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試青香牙蕉為市售，剝離果肉，備用；復(fù)合植物水解酶（酶活力≥1 500 NCU/g），諾維信（中國）生物技術(shù)公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥95%），天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；乙醇、甲醇、鹽酸、香草醛為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化銅、氯化鐵、苯甲酸鈉、山梨酸鉀為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

PL203電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SHZ-88臺(tái)式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DGG-9070B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DXF-04D手提式粉碎機(jī)，廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司；TDL-5-A飛鴿離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-32A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；752N紫外-可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 原花色素的制備、測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.2.1 原花青素制備 青香蕉皮，50℃烘干至水分含量低于10%，粉碎，過0.425 mm篩，得香蕉皮粉。準(zhǔn)確稱取1.000 g香蕉皮粉，添加一定量的復(fù)合植物水解酶，調(diào)節(jié)體系pH值為4.4，在一定的溫度下酶解一定時(shí)間，得原花色素酶解液。在原花色素酶解液中加入乙醇，提取一定時(shí)間后，在4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液減壓干燥，再于50℃恒溫烘箱烘干至含水量低于6%，得香蕉皮原花色素提取物。

1.2.2 原花色素提取得率測(cè)定 原花色素含量的測(cè)定采用香草醛-鹽酸法［22］，香蕉皮原花色素提取得率的計(jì)算公式如下：

式中，m0為提取所用香蕉皮粉的質(zhì)量（g），m1為粗提品中原花色素的質(zhì)量（g）。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取原花色素標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g，用70%甲醇定容到50 mL，得到0.2 mg/mL原花色素標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取原花色素標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，用70%甲醇定容。分別取1.00 mL上述原花色素-甲醇溶液，加入6.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的香草醛溶液和3.00 mL 36%～38%濃鹽酸，搖勻后避光反應(yīng)30 min。以70%甲醇作空白，在500 nm處測(cè)吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.4536x+0.0012，R2=0.9991。

1.3 酶解輔助提取法酶解試驗(yàn)的工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）酶添加量體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花色素提取得率的影響。分別以0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的酶添加量，在50℃條件下酶解60 min，再用65%乙醇以料液比1∶23（W/V，g/mL）、提取溫度50℃的條件下提取90 min，測(cè)定原花色素的提取得率。（2）酶解溫度對(duì)原花色素提取得率的影響。以0.6%的酶添加量，分別在35、40、45、50、55、60℃的條件下酶解60 min，再用65%乙醇以料液比1∶23、提取溫度50℃的條件下提取90 min，測(cè)定原花色素的提取得率。（3）酶解時(shí)間對(duì)原花色素提取得率的影響。以0.6%的酶添加量，在50℃條件下分別酶解15、30、45、60、75、90 min，再用65%乙醇以料液比1∶23、提取溫度50℃的條件下提取90 min，測(cè)定原花色素的提取得率。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原花色素的提取得率為考查指標(biāo)，選擇酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。復(fù)合酶輔助提取法酶解試驗(yàn)各因素水平的選取如表1所示。

表1 酶解正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平

1.4 酶解輔助提取法提取試驗(yàn)的工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）提取溫度對(duì)原花色素提取得率的影響。以0.8%的酶添加量，在50℃條件下酶解45 min，再用65%乙醇以料液比 1∶23，分別在 30、40、50、60、70、80℃提取溫度下提取90 min，測(cè)定原花色素的提取得率。（2）料液比對(duì)原花色素提取得率的影響。以0.8%的酶添加量，在50℃條件下酶解45 min，再用65%乙醇，分別以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（W/V，g/mL），提取溫度 50℃條件下提取90 min，測(cè)定原花色素的提取得率。（3）提取時(shí)間對(duì)原花色素提取得率的影響。以0.8%的酶添加量，在50℃條件下酶解45 min，再用65%乙醇以料液比1∶23，在50℃提取溫度下分別提取30、60、90、120、150 min，測(cè)定原花色素的提取得率。

1.4.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原花色素的提取得率為考查指標(biāo)，選擇提取溫度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。復(fù)合酶輔助提取法各因素水平的選取如表2所示。

表2 提取正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平

1.5 香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的研究

1.5.1 溫度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響（1）貯存溫度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響。配制濃度約為1.0 mg/mL的原花色素溶液，分別置于25、4、-18℃下貯藏5 d，每隔1 d測(cè)定1次原花色素含量，平行測(cè)定3次，觀察貯存溫度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響。（2）加熱溫度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響。配制濃度約為1.0 mg/mL的原花色素溶液，分別置于50、75、100℃水浴中保溫8 h，每隔2 h測(cè)定1次原花色素含量，平行測(cè)定3次，并按下式計(jì)算原花色素的保留率，觀察加熱溫度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響。

式中，m0為原溶液中原花色素的含量（mg/mL），m1為反應(yīng)后溶液中原花色素的含量（mg/mL）。

1.5.2 檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響 將檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸分別添加到約1.0 mg/mL原花色素溶液中，使得溶液中檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸的濃 度 分 別 為 0、0.2、0.4、0.6、1.0和 2.0 mg/mL。將混合好的溶液在50℃下保溫8 h，每隔2 h測(cè)定1次原花色素含量，平行測(cè)定3次，并按1.5.1方法計(jì)算原花色素的保留率，觀察檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響。

1.5.3 金屬離子對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響 將氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化銅和氯化鐵分別添加到約1.0 mg/mL原花色素溶液中，使得溶液中5種金屬離子的濃度為0、0.1、0.3、0.5 mol/L。將混合好的溶液在50℃下保溫8 h，每隔2 h測(cè)定1次原花色素含量，平行測(cè)定3次，并按1.5.1方法計(jì)算原花色素的保留率，觀察5種金屬離子對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響。

1.5.4 防腐劑對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響將苯甲酸鈉和山梨酸鉀分別添加到1.0 mg/mL原花色素溶液中，使得溶液中苯甲酸鈉和山梨酸鉀的濃度分別0、1.0、2.0和3.0 mg/mL。將混合好的溶液在50℃下保溫8 h，每隔2 h測(cè)定1次原花色素含量，平行測(cè)定3次，并按1.5.1方法計(jì)算原花色素的保留率，觀察苯甲酸鈉和山梨酸鉀對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法酶解試驗(yàn)的工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 酶添加量對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖1可知，隨著酶添加量增加，原花色素的提取得率呈現(xiàn)先增大后平緩的趨勢(shì)。當(dāng)酶添加量較少時(shí)，酶與底物結(jié)合充分，提取得率隨著酶添加量增加而提高；隨著酶添加量的升高，底物不足，未能對(duì)酶達(dá)到飽和，此時(shí)隨著酶添加量增加原花色素提取得率變化不顯著。因此，綜合考慮選擇0.8%為最適添加量。

圖1 酶添加量對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.1.2 酶解溫度對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，原花色素的提取得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。50℃時(shí)，原花色素的提取得率最高。溫度對(duì)原花色素的影響是雙重性的，隨著溫度升高，酶解反應(yīng)速度加快，酶活力越大，然而溫度過高會(huì)使酶發(fā)生變性，酶解速率和酶解效果都會(huì)受到影響。因此，選擇50℃為最佳酶解溫度。

圖2 酶解溫度對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，原花色素的提取得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為45 min時(shí)，原花色素的提取得率最高。隨著酶解時(shí)間的延長，酶解逐漸完全，原花色素逐漸被釋放到溶液中，提取得率逐漸增大，但溶液中原花色素的含量不斷增多，會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)造成抑制；且原花色素暴露在細(xì)胞外時(shí)間過長，易被氧化和破壞。因此，選擇45 min為最佳酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.1.4 酶解輔助提取法酶解試驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 復(fù)合酶輔助提取法酶解試驗(yàn)的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，分析極差R可知，影響香蕉皮原花色素酶解效果的因素大小順序?yàn)槊柑砑恿浚˙）＞酶解溫度（A）＞酶解時(shí)間（C）。根據(jù)均值大小可知，酶解的最優(yōu)條件為A2B2C2，該組合未在正交表中出現(xiàn)。在A2B2C2條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，所得原花色素的提取得率平均為1.655%，高于A2B2C3條件下的提取得率。因此，復(fù)合酶輔助提取法的最佳酶解條件為：酶解溫度50℃，酶添加量0.8%，酶解時(shí)間45 min。

表3 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法酶解試驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法提取試驗(yàn)的工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 提取溫度對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，原花色素的提取得率呈現(xiàn)先增大后平緩的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，原花色素的提取得率最高。在一定范圍內(nèi)，溫度的提高有利于原花色素的提取，但在高溫條件下，原花色素的結(jié)構(gòu)遭到破壞，使得提取得率上升平緩甚至有所下降。因此，選擇70℃為最佳提取溫度。

2.2.2 料液比對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖5可知，隨著料液比的增加，原花色素的提取得率呈現(xiàn)先增大后平緩的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，原花色素的提取得率最高。此時(shí)，原花色素幾乎全部被提取出來，繼續(xù)加大溶劑用量對(duì)提取效果無顯著影響。因此，選擇1∶25為最佳料液比。

圖4 提取溫度對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響

圖5 料液比對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響 由圖6可知，隨著提取時(shí)間的延長，原花色素的提取得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，原花色素的提取得率最高。原花色素的結(jié)構(gòu)中含有大量羥基，長時(shí)間高溫加熱，會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，使得提取得率降低。因此，選擇90 min為最佳提取時(shí)間。

2.2.4 酶解輔助提取法提取試驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 復(fù)合酶輔助提取法提取試驗(yàn)的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。分析極差R可知，影響原花色素提取效果的因素大小順序?yàn)椋毫弦罕龋–）＞提取時(shí)間（B）＞提取溫度（A）。根據(jù)均值大小可知，香蕉皮中原花色素提取的最優(yōu)條件為A1B1C1，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。在A1B1C1條件下試驗(yàn)重復(fù)3次，所得原花色素的提取得率平均為1.702%。因此，復(fù)合酶輔助提取法的最佳提取條件為：料液比1∶23，提取溫度65℃，提取時(shí)間75 min。

圖6 提取時(shí)間對(duì)香蕉皮原花色素提取得率的影響

表4 香蕉皮原花色素酶解輔助提取法提取試驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 香蕉皮原花色素穩(wěn)定性研究結(jié)果

圖7 溫度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響

2.3.1 溫度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響由圖7可知，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，香蕉皮原花色素的穩(wěn)定性逐漸降低。由圖7A可知，當(dāng)溫度較低時(shí)，香蕉皮原花色素相對(duì)較穩(wěn)定。在室溫（25℃）、冰箱冷藏（4℃）和凍藏（-18℃）條件下貯存5 d，原花色素的保留率分別為88.11%、96.83%和99.24%。圖7B顯示，隨著加熱溫度的升高，原花色素降解速度逐漸加快。在50、75、100℃條件下加熱8 h，原花色素的保留率分別為88.62%、79.74%和56.77%。由此可見，低溫貯藏可較好地保護(hù)原花色素，而高溫加熱會(huì)破壞其穩(wěn)定性。

2.3.2 檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸濃度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響 由圖8可知，隨著檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸濃度的增大，對(duì)香蕉皮原花色素的保護(hù)作用呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)溶液中檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸的濃度為0.6、0.6、0.4 mg/mL時(shí)，原花色素的穩(wěn)定性最好，8 h后原花色素的保留率分別為94.90%、94.31%和96.34%。

2.3.3 金屬離子濃度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響 從圖9可以看出，隨著溶液中金屬離子濃度的增大，原花色素的穩(wěn)定性逐漸降低。當(dāng)溶液中Na+、Ca2+、K+、Cu2+和Fe3+的濃度為0.5 mol/L時(shí)，8 h后原花色素的保留率分別為81.78%、79.08%、81.73%、60.90%和40.52%。當(dāng)溶液中加入Fe3+時(shí)，溶液由紅棕色變?yōu)樽虾谏?，且伴有少量絮狀沉淀產(chǎn)生；當(dāng)溶液中加入Cu2+時(shí)，溶液變?yōu)榍嗑G色。由此可見，Na+、Ca2+和K+對(duì)原花色素的穩(wěn)定性影響較小，Cu2+和Fe3+對(duì)原花色素的穩(wěn)定性破壞顯著。

圖8 檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸濃度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響

圖9 金屬離子濃度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響

2.3.4 防腐劑濃度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響 圖10顯示，隨著防腐劑濃度的增加，原花色素的穩(wěn)定性逐漸降低。當(dāng)苯甲酸鈉和山梨酸鉀的濃度為1.0（mg/mL）時(shí)，8 h后原花色素的保留率分別為85.71%和85.34%?？芍?，當(dāng)防腐劑濃度較低時(shí)，其對(duì)原花色素的穩(wěn)定性影響較小。

圖10 防腐劑濃度對(duì)香蕉皮原花色素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，香蕉皮原花色素酶解輔助提取法酶解試驗(yàn)的最佳工藝條件為：酶添加量0.8%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間45 min；提取試驗(yàn)的最佳工藝條件為：料液比1∶23（g/mL），提取溫度65℃，提取時(shí)間75 min。在最佳工藝條件下，原花色素的提取得率為1.702%，與溶劑提取法的0.459%和超聲波輔助提取法的0.685%相比［23］，酶解輔助提取法的提取得率有了明顯提高。且酶解輔助提取法操作簡便、條件溫和、綠色環(huán)保，是目前天然產(chǎn)物提取較為常用的輔助手段。但是，本研究將酶解和提取兩個(gè)部分單獨(dú)進(jìn)行，導(dǎo)致耗時(shí)較長，今后可進(jìn)一步完善工藝流程，提高提取效率。

隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，香蕉皮原花色素穩(wěn)定性逐漸降低。因此，應(yīng)將原花色素儲(chǔ)存在低溫環(huán)境中，在制備和使用的過程中也應(yīng)盡量避免溫度過高。檸檬酸、蘋果酸和抗壞血酸對(duì)香蕉皮原花色素具有保護(hù)作用。因此，可以在原花色素的保存和使用過程中加入一定量的檸檬酸、蘋果酸或抗壞血酸作為保護(hù)劑。Na+、Ca2+、K+、Cu2+和 Fe3+等金屬離子會(huì)對(duì)香蕉皮原花色素起破壞作用，其中Cu2+和Fe3+的影響最為顯著。因此，在原花色素的制備、保存和使用過程中應(yīng)盡量避免與Cu2+和Fe3+接觸。苯甲酸鈉和山梨酸鉀會(huì)降低香蕉皮原花色素的穩(wěn)定性，但影響相對(duì)較小。因此，在保存和應(yīng)用過程中可以適量加入苯甲酸鈉和山梨酸鉀。