閆一芳，王強(qiáng)*

(1. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，存濟(jì)醫(yī)學(xué)院，北京 100049)

在斑馬魚(yú)胚胎中，隨著原腸期胚胎的外包、內(nèi)卷、匯聚和延伸等運(yùn)動(dòng)使整個(gè)胚胎細(xì)胞按照準(zhǔn)確有序的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行重新排列，胚胎背腹軸、前后軸和左右軸線的建立，使三胚層誘導(dǎo)生成的各個(gè)組織器官沿著三個(gè)軸線進(jìn)行相對(duì)準(zhǔn)確的定位。就背腹軸而言，各組織器官的前體細(xì)胞沿胚胎的背腹軸線分布，所處胚胎的位置不同，具有不同的發(fā)育命運(yùn)，例如位于背側(cè)的軸線中胚層前體細(xì)胞將發(fā)育為脊索和脊索板，而分布在腹側(cè)的中胚層前體細(xì)胞則最終發(fā)育為血液等。在斑馬魚(yú)胚胎中，背部組織中心指導(dǎo)背腹軸的正確形成，對(duì)胚胎早期形態(tài)構(gòu)建至關(guān)重要。闡明體軸建立的分子機(jī)制，對(duì)于深入了解胚胎早期發(fā)育機(jī)理有著重要的科學(xué)意義。

1 背部組織中心簡(jiǎn)述

在20世紀(jì)20年代，德國(guó)胚胎學(xué)家Hans Spemann將兩棲類(lèi)動(dòng)物(蠑螈)原腸胚胚孔背唇細(xì)胞，移植到另一枚胚胎的腹側(cè)。他們發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)育的進(jìn)行，移植的胚孔背唇細(xì)胞可以誘導(dǎo)宿主胚胎腹側(cè)細(xì)胞形成包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的第二體軸[1-2]。這些具有誘導(dǎo)作用的胚孔背唇細(xì)胞被命名為Spemann’s organizer，Hans Spemann本人也于1935年榮獲諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1933年，英國(guó)學(xué)者C.H. Waddington發(fā)現(xiàn)將供體鴨胚的原結(jié)移植到發(fā)育時(shí)期相同的寄主雞胚的上胚層之后，同樣可以誘導(dǎo)形成次生胚[3-4]。大約60年后的1998年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)雞胚中的亨氏小結(jié)以及斑馬魚(yú)胚胎胚盾期的胚盾(embryonic shield)均可誘導(dǎo)出第二體軸[5]。同時(shí)期，美國(guó)、英國(guó)多位發(fā)育生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，將7 d小鼠胚胎的原結(jié)移植到受體胚胎的后外側(cè)，同樣可誘導(dǎo)形成第二體軸[5-7]。2018年，美國(guó)洛克菲洛大學(xué)的Ali h. Brivanlou研究組將人類(lèi)胚胎干細(xì)胞移植至雞胚中，首次驗(yàn)證了人體細(xì)胞背部組織中心的存在[8]。因此，脊椎動(dòng)物胚胎的背腹軸建立，存在進(jìn)化上保守的結(jié)構(gòu)和過(guò)程。

2 母源 Wnt/β-catenin 信號(hào)調(diào)控背部組織中心形成的分子機(jī)制

兩棲類(lèi)動(dòng)物胚胎受精時(shí)由于精子進(jìn)入卵的影響，卵子皮質(zhì)與卵黃在重力作用下進(jìn)行移動(dòng)，發(fā)生皮質(zhì)旋轉(zhuǎn)(cortical rotation)，一些定位在植物極、含有調(diào)控背部組織中心形成的因子開(kāi)始在預(yù)定胚胎背部區(qū)域積累，產(chǎn)生有色素差異的灰色新月區(qū)(gray crescent)[9]。這個(gè)灰色新月區(qū)產(chǎn)生的細(xì)胞隨后發(fā)育成為胚孔背唇，開(kāi)始原腸作用，并在原腸期產(chǎn)生有規(guī)律的細(xì)胞重排及相互誘導(dǎo)，發(fā)育成為背部組織中心(dorsal organizer)。

科學(xué)家移除早期斑馬魚(yú)胚胎受精卵的植物極后，發(fā)現(xiàn)胚胎缺乏神經(jīng)組織和背部中胚層等背部組織，胚胎呈明顯的腹部化表型，表明斑馬魚(yú)胚胎植物極存在某種背部決定因子[10]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚(yú)受精卵中，定位在植物極的背部決定因子通過(guò)微管系統(tǒng)以不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式向動(dòng)物極胚盤(pán)運(yùn)輸。編碼驅(qū)動(dòng)蛋白連接分子蛋白的基因syntabulin，其突變體tokkaebi胚胎因無(wú)法形成微管將母源因子順利轉(zhuǎn)運(yùn)至預(yù)定背部區(qū)域，導(dǎo)致背腹軸缺陷[11-12]。在卵子產(chǎn)生過(guò)程中，Balbiani小體(Balbiani body)在緊鄰細(xì)胞核的植物極一側(cè)產(chǎn)生并遷移到預(yù)定植物極底部，然后裂解、釋放其包含的mRNA和蛋白，這其中就有母源表達(dá)的背部決定因子。接著， syntabulin和kinesin I以微管蛋白束依賴(lài)的方式將背部決定因子轉(zhuǎn)運(yùn)到預(yù)定背部區(qū)域[13]。

2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路簡(jiǎn)介

Wnt最開(kāi)始因果蠅中wingless基因的一個(gè)突變導(dǎo)致的無(wú)翅膀表型被發(fā)現(xiàn)，目前已知超過(guò)19種Wnt配體[14]。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路主要是對(duì)其關(guān)鍵的效應(yīng)分子β-catenin的調(diào)控。當(dāng)沒(méi)有Wnt信號(hào)的時(shí)候，Axin、APC(adenomatous polyposis coli protein)、CK1(casein kinase 1)和GSK-3β(glycogen synthase kinase-3β)組成的降解復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)和β-catenin結(jié)合，GSK-3β和CK1將其N(xiāo)端磷酸化，而N端磷酸化的β-catenin會(huì)被E3泛素連接酶β-TrCP(β-transducin repeat-containing protein)識(shí)別然后導(dǎo)致其通過(guò)蛋白酶體途徑降解。而Wnt配體和受體Frizzled以及輔助受體LRP6(lipoprotein receptor-related protein 6)結(jié)合后，GSK3-β或者CK1會(huì)將LRP6胞內(nèi)端磷酸化，然后Axin在Dvl (Dishevelled)依賴(lài)的方式上膜結(jié)合LRP6，從而有效抑制降解復(fù)合物的活性使β-catenin變得穩(wěn)定并進(jìn)入細(xì)胞核，代替核內(nèi)抑制因子Groucho與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[15-16]。

2.2 Wnt/β-catenin信號(hào)在背腹分化過(guò)程中的作用

脊椎動(dòng)物胚胎中，母源 Wnt/β-catenin 信號(hào)起始組織中心誘導(dǎo)。2005年，美國(guó)辛辛那提兒童醫(yī)院Tao 等發(fā)現(xiàn)，使用反義寡核苷酸MO(morpholino)敲低非洲爪蟾胚胎的Wnt11，引起胚胎背部組織發(fā)育缺陷[17]。兩年以后，該實(shí)驗(yàn)室的Matt Kofron的研究表明，Wnt11可通過(guò)其輔助受體LRP6激活信號(hào)通路，從而確定胚胎背部命運(yùn)[18]。但是，在2000年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院賀熹教授實(shí)驗(yàn)室的研究，發(fā)現(xiàn)在爪蟾胚胎中過(guò)表達(dá)顯性失活形式(dominant negative)的LRP6突變體，在受體水平上抑制Wnt信號(hào)通路，并不會(huì)導(dǎo)致胚胎背腹軸缺陷[19]。

2011年，美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)Bernard Thisse實(shí)驗(yàn)室在《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》撰文，認(rèn)為Wnt8a是斑馬魚(yú)胚胎背部組織形成的決定因素[20]。2018年，日本名古屋大學(xué)Masahiko Hibia實(shí)驗(yàn)室通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技術(shù)制備了斑馬魚(yú)母源Wnt8a突變體，發(fā)現(xiàn)缺失母源Wnt8a并沒(méi)有明顯影響胚胎背腹軸建立[21]。由此看來(lái)，在脊椎動(dòng)物胚胎背腹軸建立過(guò)程中，Wnt蛋白配體可能并不是真正的背部決定因子，而且β-catenin信號(hào)的激活似乎與Wnt配體及其跨膜受體無(wú)關(guān)。2018年，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孟安明院士研究團(tuán)隊(duì)，與該學(xué)院陶慶華教授實(shí)驗(yàn)室合作，首次報(bào)道了一個(gè)斑馬魚(yú)母源突變體“葫蘆娃”(Huluwa, HWA)，發(fā)現(xiàn) Huluwa 蛋白定位于囊胚早期預(yù)定背側(cè)細(xì)胞的細(xì)胞膜上。缺失胞外結(jié)構(gòu)域的“葫蘆娃”蛋白突變體仍具有指導(dǎo)背腹軸建立的功能，表明其功能發(fā)揮可能不需要胞外信號(hào)。Huluwa 蛋白在不依賴(lài)于Wnt配體與受體的情況下，促進(jìn)β-catenin在胞質(zhì)中穩(wěn)定，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，決定背部命運(yùn)與體軸形成[22]。

β-catenin對(duì)于斑馬魚(yú)的組織中心胚盾的形成和背腹分化至關(guān)重要，缺失β-catenin的突變體ichabod胚胎背部組織中心無(wú)法正常形成，導(dǎo)致背腹軸的建立嚴(yán)重缺陷[23-24]。我們的相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鳥(niǎo)苷酸因子Net1激活RhoA家族的G蛋白，干擾PAK1二聚體的形成，激活PAK1激酶活性，從而磷酸化β-catenin 675位絲氨酸，抑制β-catenin與組蛋白去乙酰化酶HDAC結(jié)合，促進(jìn)Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄，在胚胎背部組織中心形成和背腹軸建立過(guò)程中發(fā)揮重要作用[25]。母源Wnt信號(hào)激活的β-catenin促進(jìn)背部特異基因的轉(zhuǎn)錄，包括squint、goosecoid、bozozok和chordin(chd)等，誘導(dǎo)背部組織中心的形成[26]。而合子期Wnt信號(hào)與BMP信號(hào)共同調(diào)控vox/vent/ved轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達(dá)，抑制背部組織中心發(fā)育[27-30]。

3 BMP信號(hào)調(diào)控背腹軸建立的分子機(jī)制

3.1 BMP 信號(hào)通路簡(jiǎn)介

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)最早由于其誘導(dǎo)異位骨形成被鑒定出來(lái)，是一類(lèi)歸屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)超家族的多功能胞外分泌蛋白[31-32]。迄今共發(fā)現(xiàn)20多種結(jié)構(gòu)功能相關(guān)BMP，大多在胚胎發(fā)生和器官形態(tài)發(fā)生方面起著重要作用。BMP包括果蠅體內(nèi)的Decapentaplegic (Dpp), Screw (Scw)和Glassbottom-boat (Gbb)，以及脊椎動(dòng)物體內(nèi)的BMP2/4, BMP5/6/7/8和BMP-9/10等[33-35]。BMP蛋白配體在細(xì)胞表面形成二聚體結(jié)合到BMP I型和II型受體上，隨后組成型激活的II型受體磷酸化激活I(lǐng)型受體, I 型受體招募并磷酸化BMP信號(hào)通路胞內(nèi)效應(yīng)蛋白Smad1/5/8[36-37]。磷酸化的Smad1/5/8與Smad4形成復(fù)合體，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控BMP靶基因的表達(dá)[37-39]。

3.2 BMP 信號(hào)通路與背腹軸建立

在斑馬魚(yú)胚胎中，bmp2b和bmp7a最初表達(dá)在中囊胚期轉(zhuǎn)換后不久的整個(gè)胚盤(pán)，形成異二聚體以激活Smad1/5/8[40]。在囊胚晚期及至原腸胚初期，位于背部區(qū)域的BMP很快會(huì)被BMP拮抗因子chordin所抑制，使得BMP形成腹部濃度高而背部濃度低的濃度梯度。缺失Bmp2b、Bmp7和I型受體Alk8以及轉(zhuǎn)錄的效應(yīng)因子Smad5均導(dǎo)致胚胎的背部化[41-44]。在bmp2b的突變體swirl中，胚胎背部化嚴(yán)重，注射爪蟾BMP4 mRNA或者斑馬魚(yú)bmp2b均可挽救這種背部化表型[44]。在bmp7 的突變體snailhouse中，胚胎同樣有嚴(yán)重背部化的表型，外源的爪蟾BMP7和斑馬魚(yú)bmp7均可以挽救這種表型[42, 45]。在BMP拮抗因子chordin的突變體choidino中，胚胎呈腹部化表型，且bmp2b表達(dá)范圍擴(kuò)大[28]。敲低斑馬魚(yú)中的表達(dá)在胚盾的BMP配體Admp(anti-dorsalizing morphogenetic protein)的表達(dá)，致使胚胎有輕微背部化表型[46-47]。在BMP信號(hào)I型受體ALK8的突變體lost-a-fin中，胚胎也是嚴(yán)重背部化表型，但位于其上游的bmp2b或者bmp7 mRNA都不能挽救這種表型，而是位于其下游的smad5 mRNA可以挽救[41, 48]。同樣的，在BMP信號(hào)通路下游Smad5的突變體somitabun中，胚胎也有背部化表型[43]。蛋白磷酸酶Ppp4c通過(guò)與Smad1/5直接互相作用，增強(qiáng)BMP靶基因的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)BMP信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是一個(gè)BMP信號(hào)的正向調(diào)控因子，促進(jìn)胚胎早期的腹部組織發(fā)育[49]。

在斑馬魚(yú)背腹分化過(guò)程中，BMP信號(hào)濃度梯度的形成受到一系列分泌因子的調(diào)控，包括背部分泌的BMP拮抗因子chordin、noggin1和follistatin-like 1b，腹部分泌的BMP信號(hào)的調(diào)控因子Bmp1a、Twsg1a、Crossveinless 2和Sizzled等。例如，chordin的突變體choidino胚胎呈腹部化表型[28]。Crossveinless2，編碼蛋白為CV-2，表達(dá)在原腸胚期胚胎的腹部，可以增強(qiáng)BMP信號(hào)[50]。

4 參與斑馬魚(yú)胚胎背腹軸建立的其他信號(hào)通路

脊椎動(dòng)物的背腹分化是一個(gè)需要多條信號(hào)通路精確調(diào)控的過(guò)程。在爪蟾中，Nodal與母源β-catenin共同調(diào)控背腹軸的起始。爪蟾胚胎處于4000細(xì)胞時(shí)期時(shí)，位于植物極的母源因子VegT激活合子信號(hào)，這些合子信號(hào)則誘導(dǎo)組織中心的形成，調(diào)控背腹分化[51]。VegT編碼T-box轉(zhuǎn)錄因子，在卵母細(xì)胞和受精卵中定位在植物極， VegT激活的合子信號(hào)一般指TGF-β超家族成員的Derrière和Nodal相關(guān)基因Xnr1、Xnr2、Xnr4、Xnr5 和Xnr6，這種激活誘導(dǎo)組織中心的形成，確定背腹軸的形成[52-54]。另一個(gè)母源表達(dá)的TGF-β超家族成員Vg1也是Xnr1和Xnr2表達(dá)所必須的，實(shí)驗(yàn)表明，使用顯性抑制形式(dominant negative)的突變Vg1會(huì)導(dǎo)致背部中胚層有缺陷[55]。

斑馬魚(yú)胚胎Nodal基因squint和cyclops參與了背腹分化。研究發(fā)現(xiàn)Squint蛋白是長(zhǎng)距離作用因子，而Cyclops作用距離相對(duì)較短。原腸胚期，母源 Wnt 信號(hào)激活 Squint在背部高水平表達(dá)誘導(dǎo)背部中內(nèi)胚層形成， 相對(duì)低濃度的 Nodal 信號(hào)與其他信號(hào)一起誘導(dǎo)腹部中胚層形成。

FGF信號(hào)在背腹分化過(guò)程中的主要作用是抑制BMP信號(hào)[56]。在斑馬魚(yú)中，囊胚期時(shí)fgf3/fgf8/fgf24主要表達(dá)在背部邊緣細(xì)胞，抑制背部表達(dá)的bmp2b和bmp7[56-57]。單獨(dú)缺失fgf8不足以使胚胎有腹部化表型，不過(guò)它的缺失可以增加chordin突變體的腹部化[57]，表明FGF8與其他的FGF蛋白有功能冗余。同時(shí)，在缺失FGF信號(hào)時(shí)，β-catenin不能單獨(dú)挽救icbabod突變體的表型[58]，表明β-catenin下游需要FGF信號(hào)一起來(lái)誘導(dǎo)組織中心的形成。

5 展望

近年來(lái)的隨著發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，胚胎背腹軸建立的分子機(jī)制越來(lái)越詳盡和清晰。但是還有以下重要的問(wèn)題需要進(jìn)一步的探索。在母源Wnt信號(hào)激活機(jī)制方面，背腹決定因子如Huluwa如何進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)運(yùn)輸，與何種細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)等問(wèn)題還沒(méi)有清晰的闡釋。另一方面，BMP濃度的形成總是受到來(lái)自信號(hào)通路各個(gè)組分水平變化、溫度差異、大小不同，甚至子代細(xì)胞中的不對(duì)等分配等因素的干擾。但事實(shí)上， BMP濃度梯度的形成以及胚胎的背腹軸建立過(guò)程具有很強(qiáng)的發(fā)育穩(wěn)定性，可以對(duì)抗信號(hào)通路活性的波動(dòng)。目前對(duì)BMP濃度梯度和背腹軸發(fā)育穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制所知甚少。對(duì)于這些重要科學(xué)問(wèn)題的回答，將極大促進(jìn)我們對(duì)于胚胎背腹軸建立的分子機(jī)制的理解。