陳 輝

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

豬的人工授精（AI）技術(shù)是一種優(yōu)良的種豬繁育技術(shù)，AI 可以改善種豬的繁育利用率、促進(jìn)豬群遺傳改良的進(jìn)展以及不同場(chǎng)間的基因交流。該技術(shù)為全世界大多數(shù)集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)企業(yè)所采用，隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬進(jìn)程的加快，AI 技術(shù)在我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的作用[1]。隨著養(yǎng)豬規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大，養(yǎng)殖生產(chǎn)廠家對(duì)優(yōu)質(zhì)公豬精液的需求量日益增加，AI 技術(shù)使用的效果在很大程度上取決于公豬精液品質(zhì)的好壞，因而改善優(yōu)秀種公豬精液保存的效果對(duì)AI 技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用具有積極意義。文章從影響種公豬精液保存效果的因素作了較為系統(tǒng)的闡述，從抗凍劑[2]、抗氧化劑[3]、抗菌肽[4]、稀釋液配方及方法[5]等方面闡述了對(duì)種公豬精液保存效果的影響，并簡(jiǎn)要地分析了種公豬精液品質(zhì)的評(píng)價(jià)體系。筆者結(jié)合國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究，就影響種公豬精液保存效果的因素分析加以綜述，闡明各因素對(duì)種公豬精液保存效果的影響，旨在為種豬繁育研究人員、公豬站以及種豬生產(chǎn)企業(yè)一線人員提供思路和科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)場(chǎng)間的遺傳交流，進(jìn)一步改善我國(guó)整體養(yǎng)豬生產(chǎn)水平以及地方畜禽資源的保種情況，打造出中國(guó)種豬種業(yè)航母。

1 種公豬精液品質(zhì)保存效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)

在現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)中，種公豬精液品質(zhì)對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)的效益具有很大影響。我國(guó)豬精液品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 25172-2010）要求檢測(cè)公豬精液的外觀（要求顏色呈乳白色，無(wú)雜質(zhì)）、精子密度（要求高于1 億/mL）精子活力（要求高于0.6）、每劑量直線前進(jìn)的精子數(shù)（要求高于25 億）、精液pH（精液呈弱堿性，要求pH 在7.0 ～7.8 之間）、頂體完整率（要求高于51%為合格）以及畸形率（要求低于20%）等指標(biāo)來(lái)衡量精液保存的效果[6]。除此以外，部分企業(yè)和種公豬站也會(huì)對(duì)精子的活動(dòng)能力、精液中相關(guān)酶（抗氧化性酶）、冷休克指標(biāo)以及微生物等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行全面評(píng)定，但目前這些企業(yè)要求尚無(wú)具體標(biāo)準(zhǔn)。

2 影響種公豬精液保存效果的因素

2.1 抗凍劑

冷凍保存法是長(zhǎng)期保存種豬精液的有效措施，豬精液對(duì)低溫敏感，在冷凍過(guò)程會(huì)使豬精液發(fā)生“冷休克”現(xiàn)象，從而降低其使用價(jià)值，因而大量的學(xué)者針對(duì)這一現(xiàn)象開發(fā)了多種抗凍劑。Fang 等[2]在大白豬精液緩沖液中添加了40%的異源精漿（SP），觀察其對(duì)凍融精液品質(zhì)的影響，與對(duì)照組比（未添加SP），SP 組精液的活力和精子穿透力顯著增加（P ＜0.05），降低了精子低溫獲能和酪氨酸磷酸化（P ＜0.05），同時(shí)觀察到AI 母豬的妊娠率顯著增加了42.64%（P＜0.05）。Trzcinska 等[7]發(fā)現(xiàn)在雜交豬（波蘭長(zhǎng)白×大白豬）精液冷凍保存液中添加1.0 mM 丁基化羥基甲苯（BHT）可以改善豬精液冷凍保存效果，該研究觀察到使用添加BHT 的冷凍精液進(jìn)行AI 可以顯著降低精液的脂質(zhì)過(guò)氧化（P ＜0.001），顯著增加精子的運(yùn)動(dòng)能力、膜完整性以及頂體完整性（P＜0.001），表明添加1.0 mMBHT有利于精液冷凍保存以及提高精子的受精能力。有研究發(fā)現(xiàn)，在精液冷凍保存液中添加鴕鳥蛋黃（LPFO）可提高凍融后精子的活力，提高有效精子數(shù)[8]。有研究表明，在豬精液冷凍培養(yǎng)液中添加2 mM 還原型谷胱甘肽（GSH）以探索其對(duì)精液冷凍保存和凍融精子品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，使用添加GSH 后的精液顯著提高了分娩率、總產(chǎn)仔數(shù)以及產(chǎn)活仔數(shù)（P ＜0.05），表明GSH 對(duì)冷凍保存精液的品質(zhì)具有很好的改善作用[9]。Athurupana 等[10]研究了海藻糖替代部分甘油對(duì)精液冷凍保存效果的影響，使用100 mM 海藻糖替代冷凍劑甘油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)解凍后精子的活力無(wú)顯著變化，但替代后顯著改善了解凍精子的活動(dòng)性、顯著增加了線粒體膜電位（MMP），表明用海藻糖替代部分甘油是可行的，對(duì)精液冷凍保存效果具有改善作用。

2.2 抗氧化劑

精子在冷凍保存過(guò)程中容易被氧化，導(dǎo)致受精能力降低乃至喪失，因而開發(fā)一種抗氧化劑對(duì)精液冷凍保存效果的改善具有重要意義，大量研究表明黃芪多糖（APS）、芹菜素（AP）和阿魏酸（FA）對(duì)精液冷凍保存的抗氧化效果具有改善作用。Weng 等[11]評(píng)估了黃芪多糖（APS）對(duì)低溫保存精子抗氧化性的影響，在保存液中添加了0.5 mg/mL APS，解凍后37 ℃孵育1 h 后，APS 組與對(duì)照組（未添加抗氧化劑）相比，超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性顯著增加、活性氧（ROS）濃度顯著降低（P ＜0.05），同時(shí)APS 組精液的受精率得到了改善、卵裂率和胚泡率顯著增加（P ＜0.05），表明APS 可通過(guò)改善冷凍精液的抗氧化性來(lái)改善精液的繁殖能力。芹菜素（AP）和阿魏酸（FA）是一種良好的抗氧化劑，對(duì)冷凍保存精液具有很好的改善作用，已有研究證實(shí)，在冷凍保存液中添加0.1 mmol / L AP 加0.15 mmol / L FA可增加凍融精液抗氧化酶活性，改善了凍融精液的運(yùn)動(dòng)性、質(zhì)膜完整性、頂體完整性以及線粒體活性[12]，表明兩者聯(lián)合使用具有很好的改善作用。研究證實(shí)，在冷凍稀釋液中添加0.2 g/L 芝麻酚能顯著提高解凍后豬精子活率（P ＜0.05）、改善功能完整性和抗氧化能力（P ＜0.05）[13]。

常溫保存（17 ℃條件下儲(chǔ)存）也是精液液體保存的一種主要方法，為防止液體精液在保存期間發(fā)生氧化應(yīng)激，Wang 等[14]首次在精液BTS 保存液中添加了不同劑量（0、10、20、40 和80 mM）的L-谷氨酰胺（L-Glu），以探索L-Glu 對(duì)常溫保存精液抗氧化性的影響，結(jié)果表明，添加L-Glu 后會(huì)顯著降低活性氧濃度（ROS）、同時(shí)顯著增強(qiáng)了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性和精子中谷胱甘肽（GSH）的含量；此外研究還發(fā)現(xiàn)添加20 mM Gln 時(shí)對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)性、頂體完整性以及質(zhì)膜完整性具有顯著的改善作用（P ＜0.05）。胡亞美等[15]研究結(jié)果表明，在BTS 精液稀釋液中添加50 μg/mL 原花青素（OPC）可改善藏豬精液的抗氧化性能、精子活率以及頂體完整率（P ＜0.05）。相似的研究發(fā)現(xiàn)，常溫精液稀釋液中添加0.5 μmol/L 的抗氧化劑蝦青素對(duì)17 ℃下保存精液的活力和運(yùn)動(dòng)性得到改善，研究認(rèn)為蝦青素對(duì)豬精液常溫保存具有改善作用[16]。綜上表明，稀釋液中添加適宜的抗氧化劑對(duì)精液的冷凍保存或常溫保存效果具有改善作用。

2.3 抗菌肽

精液在保存過(guò)程中容易滋生細(xì)菌微生物，從而對(duì)精液的保存效果產(chǎn)生不利影響。抗菌肽（AMP）是一種氨基酸多肽，具有廣譜殺菌活性和低耐藥性，被開發(fā)應(yīng)用于精液保存過(guò)程中。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加抗菌肽（AMP）有助于抵御微生物侵襲，進(jìn)而改善精液保存效果。Puig-Timonet 等[4]評(píng)估了豬β 防御素-1（PBD1）和豬β 防御素-2（PBD2）是否有替代抗生素的可能，在17 ℃保存精液的稀釋液中，保存10 d 后使用瓊脂評(píng)估了3 種不同濃度AMP 對(duì)微生物的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)AMP 的添加量為3 μM時(shí)具有顯著的抑菌作用，但不會(huì)對(duì)精子活力產(chǎn)生顯著影響，研究表明PBD-1 和PBD-2 可替代抗生素添加到保存液中。Sancho 等[17]在17 ℃保存的稀釋液中添加了（2.5，25 和100 μg/ mL）的微生物肽（PG1），以評(píng)估其抑菌能力，平板試驗(yàn)表明細(xì)菌數(shù)隨PG1 濃度增加而顯著降低（P ＜0.05），但精子存活率與PG1的濃度增加而顯著降低（P ＜0.05），因而需要合理選擇AMP 的濃度方能平衡抑菌和保持精液品質(zhì)。而據(jù)Bussalleu 等[18]報(bào)道，稀釋液中添加3 μM 豬骨髓抗菌肽37（PMAP-37）可以有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，同時(shí)可以很好地保存精子活力，研究認(rèn)為PMAP-37 是一種潛在抗生素替代物。除此以外，也有研究報(bào)道，陽(yáng)離子微生物肽也是潛在的抗生素替代物，研究發(fā)現(xiàn)添加低濃度環(huán)狀六肽（4 μMc-WFW，2 μMc-WWW）時(shí)的精子各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)可以有效地促進(jìn)精子進(jìn)行直線運(yùn)動(dòng)[19]。綜上說(shuō)明抗菌肽在精液保存中起著重要作用，在生產(chǎn)中應(yīng)合理選擇抗菌肽種類和濃度。

2.4 稀釋配方及稀釋方法

大量研究表明不同的稀釋液以及稀釋方法會(huì)對(duì)種公豬精液保存的效果產(chǎn)生很大的影響。在不同稀釋液對(duì)精液保存效果的影響方面，Dziekonska 等[20]研究了3 種不同商業(yè)稀釋液（BTS、Androhep（AH）、Gedil（GD））對(duì)精子預(yù)冷和凍融后的影響，結(jié)果表明，AH 稀釋液組精子質(zhì)膜完整性和ATP 含量顯著高于BTS 和GD 組（P ＜0.05），且谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性顯著高于BTS 稀釋液，綜合來(lái)看，使用AH 稀釋液有助于解凍后精子品質(zhì)的改善。賈玉川等[21]研究結(jié)果表明，使用美國(guó)某精液稀釋液后的精子活力好、活力高以及存活時(shí)間長(zhǎng)，表明其保存效果優(yōu)于日本、西班牙以及國(guó)產(chǎn)精液稀釋液。譚曉山等[22]研究發(fā)現(xiàn)自行研制稀釋液配方4 適用于杜洛克豬，而配方2 適用于大白豬（具體配方請(qǐng)見參考文獻(xiàn)）。

不同的稀釋方法對(duì)精液保存的效果也會(huì)產(chǎn)生影響，Schulze 等[23]比較了一步等溫稀釋、兩步稀釋以及三步稀釋法對(duì)精液品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)一步法稀釋后的精子的耐熱性顯著高于兩步法和三步法（P ＜0.05），同時(shí)一步法省時(shí)省力，降低了稀釋錯(cuò)誤，研究認(rèn)為在實(shí)際生產(chǎn)中選擇一步稀釋法為好。有研究指出，不同的稀釋順序（對(duì)照：將稀釋劑加入至精液中；反向：將精液加入稀釋液中）會(huì)對(duì)精子分布產(chǎn)生顯著影響（P ＝0.029）[24]。何經(jīng)緯等[25]發(fā)現(xiàn)使用精確稀釋法生產(chǎn)的常溫精液瓶數(shù)顯著高于使用傳統(tǒng)稀釋法生產(chǎn)的常溫精液量（P ＜0.05）。綜上表明，不同的稀釋液以及稀釋方法對(duì)精液保存效果具有很大影響，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況合理選擇稀釋配方及稀釋方法。

2.5 其他因素

除了上述因素對(duì)會(huì)對(duì)精液保存效果產(chǎn)生影響外，保存液的pH、季節(jié)以及溫度等因素均會(huì)對(duì)精液保存效果產(chǎn)生影響。研究表明，保持冷凍稀釋液的pH 為8（弱堿性）的條件下能夠有效改善解凍后精子的質(zhì)量[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)，溫合保存液的pH 有利于精液的常溫保存[27]。Fraser 等[28]研究表明秋冬季節(jié)時(shí)公豬的精子完整性、頂體完整率以及滲透壓耐受性顯著高于春夏季節(jié)（P ＜0.05），表明季節(jié)因素也是影響精液保存的一個(gè)重要因素。在溫度因素方面，有研究發(fā)現(xiàn)36 h 17 ℃和25 ℃下活精子數(shù)顯著高于8 ℃下保存的精子數(shù)（P ＜0.05）；在超低溫冷凍后豬豬精子活力、質(zhì)膜完整率、線粒體活性和頂體完整率顯著低于新鮮精液（P ＜0.05）[29-30]。

3 小結(jié)與展望

縱觀全文，影響豬精液保存的因素主要有抗凍劑、抗氧化劑、抗菌肽、稀釋配方以及稀釋方法等因素。除此以外，pH、季節(jié)以及溫度也是重要的影響因素；在實(shí)際生產(chǎn)中，通過(guò)在保存液添加抗凍劑、抗氧化劑以及抗菌肽，同時(shí)選擇合理的稀釋配方和稀釋方法，可以有效地改善精液保存效果，從而使精液在AI 中發(fā)揮更大的作用。但是還有諸多因素會(huì)影響豬精液的保存效果，如pH 對(duì)精液保存效果的相關(guān)研究鮮有報(bào)道、不同抗凍劑、抗氧化劑等相互配伍的相關(guān)研究較少，今后可加大相關(guān)研究的力度；同時(shí)精液相關(guān)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)還尚需完善（如可全面測(cè)定精子抗氧化性指標(biāo)、冷休克指標(biāo)等）。相信隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展以及國(guó)家AI 技術(shù)的大力推廣和使用，相關(guān)研究將會(huì)得到開展、標(biāo)準(zhǔn)將會(huì)更加完善，有效地解決上述問(wèn)題，從而進(jìn)一步改善豬精液保存的效果，發(fā)揮AI 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，使優(yōu)良公豬的繁殖性能得到更好的發(fā)揮，強(qiáng)化場(chǎng)間的遺傳交流，從整體生產(chǎn)上改善我國(guó)的生豬養(yǎng)殖水平。