林依涵　葉倩茹　沈彥伶　泮艷璐　馮芝怡　陳磊

【摘 要】目的：通過建立土三七誘導(dǎo)小鼠肝小靜脈閉塞綜合征模型，探索丹參素衍生物ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征的作用。方法：建立土三七提取液誘導(dǎo)小鼠肝小靜脈閉塞綜合征模型，除對照組外，其余各組給予土三七濃縮提取液（15g/kg/d），同時給藥組給予ADTM（60mg/kg/d），對照組給予同體積賦型劑，連續(xù)給藥四周。采用生化法檢測轉(zhuǎn)氨酶和血脂，采用蘇木素-伊紅染色（HE）檢測肝臟病理組織學(xué)改變。結(jié)果：與對照組比較，模型組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）顯著性升高，血清甘油三酯（TG）顯著性降低，總膽固醇（CHO）無明顯變化，肝組織肝竇充血嚴重，肝血竇間隙變小，肝血竇內(nèi)皮細胞增生，kuffer細胞增生。給藥組血清轉(zhuǎn)氨酶沒有降低，TG顯著性升高，病理改變明顯減輕。結(jié)論：土三七提取液可引起小鼠肝小靜脈閉塞綜合征，ADTM對土三七所誘導(dǎo)的肝小靜脈閉塞綜合征有明顯的改善作用。

【關(guān)鍵詞】土三七;吡咯烷生物堿;肝小靜脈閉塞綜合征;藥物性肝損害

中圖分類號： R284;R285文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）36-0264-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.36.125

肝小靜脈閉塞征（Hepatic venular occlusive disease ， HVOD）是指由多種原因?qū)е碌姆茄ㄐ愿涡§o脈狹窄和閉塞，從而引起肝內(nèi)竇后門靜脈高壓的肝血管性疾病[1]。據(jù)研究證明，引起該病的原因多由于攝入過多植物中的吡啶類生物堿。目前，已得到實驗證實的含吡啶類生物堿植物有土三七、狗舌草、一點紅等[2]。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)于治療肝小靜脈閉塞綜合征的藥物十分有限，并且沒有特效的治療藥物，目前臨床上對于肝小靜脈閉塞綜合征的治療主要以對癥治療為主[3]，多采用支持療法，抗凝、祛聚療法，促進肝細胞再生藥物治療法等。

已有文獻報道，丹參對土三七所致肝小靜脈閉塞綜合征有明顯的預(yù)防治療作用，在丹參預(yù)防治療組中，肝竇纖維化及中央靜脈內(nèi)膜纖維化較土三七模型組少，病變程度明顯輕于模型組，沒有明顯的肝小靜脈閉塞綜合征表現(xiàn)[4]。由此可見，丹參對于治療肝小靜脈閉塞綜合征具有一定的預(yù)防作用，且根據(jù)其實驗中給藥劑量的不同，也顯示出不同的給藥劑量對肝小靜脈閉塞綜合征的預(yù)防有不同程度的效果。

丹參素衍生物ADTM是由丹參素（DSS）與活性分子川芎嗪（TMP）結(jié)合得到的化合物。鑒于ADTM對于血管內(nèi)皮細胞的作用顯著，本實驗嘗試在動物水平上研究ADTM對土三七誘導(dǎo)的肝小靜脈閉塞綜合征的作用，一方面可為ADTM的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，另一方面可為開發(fā)或者篩選治療肝小靜脈閉塞綜合征的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR小鼠84只，雄性，體重22～24g，SPF級，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。小鼠飼養(yǎng)于恒溫恒濕屏障動物房內(nèi)。每日明暗時長各12小時，標準飼料，自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

土三七購自亳州市九康藥業(yè)銷售有限公司;丹參衍生物ADTM由暨南大學(xué)提供;甘油三酯、膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑有限公司;超聲波清洗器（上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司）、生化分析儀（北京普朗有限公司）、離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）、電子天平（奧豪斯儀器有限公司）。

1.3 土三七提取液制備和ADTM溶液配制

先取1000g土三七加水浸泡2h，將電磁爐調(diào)1300瓦進行加熱煎煮，等到藥液開始沸騰后降低功率至120瓦繼續(xù)加熱1.5h。用過濾器濾出藥液，得到藥液a，然后再次加3000ml的水用上述方法進行煎煮1.5h，濾出得到藥液b，將濾液a和b混合，然后進行加熱濃縮至500ml，最后放進冰箱冷藏備用。

1.4 動物分組與給藥

動物適應(yīng)一周后隨機分為6組：正常對照組（10只）、土三七模型組（23只）、ADTM治療組（22只），5只/籠飼養(yǎng)，每天更換水瓶，每2天更換1次墊料。ADTM治療組每天灌胃ADTM溶液60mg/kg/d，1h后，再灌胃土三七提取液15g/kg/d;模型組每天灌胃同體積賦型劑60mg/kg/d，1h后，再灌胃土三七提取液15g/kg/d;正常對照組給予同體積賦型劑。

1.5 血樣和肝組織處理

取血量需達到1ml以上，取血靜置30min，置于離心機4℃/4500rpm/離心10min，吸取上層血清放入1.5ml EP管內(nèi)，并存于冰箱冷凍。用手術(shù)剪取每只小鼠肝臟大葉同一部位三角狀組織，放于含有10%中性福爾馬林的試管中固定，留作病理檢測。剩余的肝組織用生獨立包裝于-80℃冰箱儲存。

1.6 生化法測定血清轉(zhuǎn)氨酶和血脂

按照試劑盒說明書指示，利用生化分析儀測定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的數(shù)值分析肝臟損傷情況，通過測定血清中甘油三酯（TG）和膽固醇（CHO）含量分析小鼠血脂的情況。

1.7 肝臟病理組織學(xué)檢查

取肝組織經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定后做病理切片。酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度約5μm），經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。根據(jù)肝臟病變程度進行評分。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理分析數(shù)據(jù)，采用SNK q檢驗對各組同一時間點的同一指標進行比較，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠體重的影響

小鼠灌胃28天后，土三七模型組體重增加明顯，毛發(fā)稀疏，食量明顯減退，活動明顯減少，腹腔腫大，剖腹后可見半透明腹水，試驗期間小鼠死亡17只。各組小鼠實驗前后體重都有明顯增長。與正常組比較，模型組和給藥組體重增長幅度較小。與模型組比較，給藥組體重略大，體重個體差異較明顯（表1）。

表1 各組實驗小鼠實驗前后體重分析

2.2 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST均顯著性升高，分別為正常對照組的2.5倍和1.3倍，而ADTM給藥組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST并沒有顯著性下降（表2）。

表2 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

（注：n=10，mean±SD;###P<0.001vs.正常組）

2.3 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清TG明顯降低，為對照組的63%，模型組血清CHO沒有改變。ADTM給藥組小鼠血清TG明顯升高，CHO也沒有改變（表3）。

表3 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠血脂水平

的影響

（注：n=10，mean±SD;###P<0.001vs.正常對照組;*P<0.05vs.土三七模型組）

2.4 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響

正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列緊密，細胞繞中央靜脈呈放射狀排列，未見肝細胞脂肪變性、壞死。Kuffer細胞無明顯增生，匯管區(qū)局部炎癥細胞浸潤。肝血竇正常，未見淤血、下狹窄或閉塞。未見明顯纖維化，中央靜脈未見狹窄;模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，部分肝細胞核固縮，匯管區(qū)可見炎細胞堆積，部分匯管區(qū)纖維化，部分肝細胞脂肪變性，肝竇充血嚴重，肝血竇間隙變小，肝血竇內(nèi)皮細胞增生，kuffer細胞增生。ADTM給藥組小鼠肝病理改變比模型組明顯減輕（表4、圖1）。

表4 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠肝臟病理分析

（注：—：陰性;+：陽性，+的個數(shù)表示陽性的程度）

圖1 ADTM對肝小靜脈閉塞綜合癥小鼠肝臟

病理切片圖

3 討論

丹參是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最廣泛的藥物，其主要成分丹參素（DSS）是抗心腦缺血損傷的主要活性物質(zhì)。為了提高丹參素的療效，充分發(fā)揮其治療特色，對丹參素進行了系統(tǒng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾。經(jīng)過大量的藥效與藥理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)丹參素（DSS）與活性分子川芎嗪（TMP）結(jié)合得到的化合物ADTM對血管內(nèi)皮細胞療效顯著。

本研究首先建立土三七誘導(dǎo)肝小靜脈閉塞綜合征模型，即連續(xù)灌胃土三七提取液15g/kg/d四周，模型組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST水平顯著性升高、血脂TG水平顯著降低，而CHO無明顯變化，肝小葉放射狀排列結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞脂肪變性，肝竇充血嚴重，肝血竇間隙變小，部分狹窄、閉塞，肝血竇內(nèi)皮細胞增生，kuffer細胞增生，匯管區(qū)可見纖維化。上述改變與以往研究一致[5]，均可反映出灌胃給藥土三七提取液引起小鼠肝小靜脈閉塞。丹參素衍生物ADTM（30mg/kg/d）給藥對血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST升高并沒有抑制，但可明顯緩解TG的下降，并能明顯減輕小鼠肝病理組織學(xué)改變，表明土三七提取液可引起小鼠肝小靜脈閉塞綜合征，ADTM對土三七所誘導(dǎo)的肝小靜脈閉塞綜合征有明顯的改善作用。

已有的研究表明，在土三七已發(fā)現(xiàn)超過5種吡咯烷生物堿[6]，其中3種具有較強肝毒性：千里光寧、千里光非寧和全緣千里光堿，可有效致小鼠肝小靜脈閉塞綜合征。大量的實驗研究表明川芎嗪、低分子肝素、激素等藥物可有效地緩解小鼠肝小靜脈閉塞綜合征的癥狀[7-10]，可以確定這些藥物對肝小靜脈閉塞綜合癥有一定的療效。通過本項目研究，土三七對肝小靜脈閉塞綜合征確實有誘導(dǎo)作用，可使小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST明顯升高、血脂TG顯著降低，ADTM對肝小靜脈閉塞綜合征有改善作用，但作用機制尚不明確，本實驗可為丹參素衍生物ADTM的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)。

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