戴雯，張東晨

（安徽理工大學材料科學與工程學院，安徽淮南 232001）

在選煤廠中聚丙烯酰胺常用作絮凝劑對洗煤泥水進行絮凝沉降，聚丙烯酰胺的高分子側鏈上帶有大量的活性基團，因而具有良好的水溶性和絮凝性[1]。但殘留于選煤廠循環(huán)水中的聚丙烯酰胺會影響浮選藥劑的吸附率，此外若選煤廠循環(huán)水未得到妥善處理外排到環(huán)境中將會污染地下水[2]。微生物降解聚丙烯酰胺不會對煤炭洗選的其他工藝環(huán)節(jié)產生不利影響，同時具有生物降解性，降解產物對環(huán)境無毒、無害，不會產生二次污染，具有廣泛的應用前景[3-7]。目前已有不少學者從環(huán)境中篩選出微生物菌種用于降解含聚丙烯酰胺廢水，但環(huán)境菌種的降解率偏低，且菌種生長周期較長，不適于工業(yè)化生產[8]。探究復合菌種對選煤廠循環(huán)水中殘留聚丙烯酰胺的降解效果對改善降解菌種對聚丙烯酰胺的降解特性有著十分重要的研究意義。

本文以淀粉-碘化鎘試驗測得的聚丙烯酰胺濃度計算得到的降解率為指標，考查了微生物降解菌球紅假單胞菌（Rhodopseudomonas spheroides）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對聚丙烯酰胺的降解效果，重點研究了球紅假單胞菌（Rhodopseudomonas spheroides）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）復合降解效果。采用正交試驗設計，確定和分析了它們復合降解選煤廠循環(huán)水中殘留聚丙烯酰胺的最優(yōu)試驗參數及因素影響顯著性等。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用含聚丙烯酰胺循環(huán)水

前期馴化試驗過程中用取自淮南礦業(yè)集團望峰崗選煤廠的殘留聚丙烯酰胺的濃縮池溢流液過濾滅菌后配制培養(yǎng)基馴化親本菌種，后續(xù)試驗中先用-0.5 mm的煤樣配制濃度為40 g/L煤泥水，將煤泥水自然沉降后，取上清液過濾滅菌后用于配制含不同濃度聚丙烯酰胺的選煤循環(huán)水進行降解試驗研究。

試驗中采用的聚丙烯酰胺為陰離子型聚丙烯酰胺，相對分子量為1200萬。

1.1.2 降解菌種

試驗所用的球紅假單胞菌及枯草芽孢桿菌為安徽理工大學礦業(yè)生物技術實驗室保存的菌種。密封保存于冰箱中。

1.1.3 培養(yǎng)基

球紅假單胞菌基礎培養(yǎng)液（基）：蔗糖30 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.6 g、KH2PO4·3H2O 0.4 g、CaCl20.01 g 、Fe2（SO4）30.03 g、MgSO4·7H2O 0.06 g 、MnCl2·4H2O 0.3 g、微量元素5 mL、聚丙烯酰胺0.05 g、1 000 mL去離子水、（瓊脂 20～25 g），pH=7。

枯草芽孢桿菌基礎培養(yǎng)液（基）：葡萄糖20 g、KH2PO41 g 、K2HPO41 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、瓊脂 20 g、超純水 1 000 mL、（瓊脂 20～25 g），pH=7。

降解培養(yǎng)液（基）：蔗糖 30 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.6 g、KH2PO4·3H2O 0.4 g、CaCl20.01 g、Fe2（SO4）30.03 g、MgSO4·7H2O 0.06 g 、MnCl2·4H2O 0.3 g、微量元素5 mL、聚丙烯酰胺0.05 g、1 000 mL去離子水、（瓊脂20～25 g），pH=7。

微量元素：CuSO4·5H2O 0.4 g、ZnSO4·7H2O 0.6 g、MnCl2·4H2O 0.5 g溶于 500 mL 水。

菌種培養(yǎng)基分別采用BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器在121℃條件下滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 含聚丙烯酰胺選煤循環(huán)水的配制及相關性質測定

試驗方法：用-0.5 mm的煤樣配制濃度為40 g/L的煤泥水1 L，攪拌均勻，后置于1 L量筒中自然沉降3 h后，取上清液過濾滅菌后備用。稱取不等量的聚丙烯酰胺配制含聚丙烯酰胺的循環(huán)水，利用淀粉-碘化鎘方法測定循環(huán)水中聚丙烯酰胺的濃度。

1.2.2 菌種的活化

在無菌條件下將球紅假單胞菌及枯草芽孢桿菌接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜的條件下長出完好的菌落，挑取菌落再轉接到新鮮固體培養(yǎng)基上，等長出形態(tài)完好的菌落作為活化的菌種使用，并置于冰箱中保藏。

1.2.3 菌種的培養(yǎng)及生長量的測定

菌種培養(yǎng)：在無菌環(huán)境中用接種針挑取固體培養(yǎng)基上的菌樣接種到液體培養(yǎng)基中，在30℃、轉速為130 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d；采用光電比濁計數法測定菌液的細胞總數，借助于紫外分光光度計，在波長600 nm下測定菌懸液的光密度值（OD值），測量值用于表征菌體的生長量[9-10]。以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌液吸光度值為縱坐標，繪制得到微生物生長曲線。

1.2.4 聚丙烯酰胺降解率的計算

采用淀粉-碘化鎘法測定液體環(huán)境中聚丙烯酰胺的濃度[11-14]。用吸光度（A）來表征聚丙烯酰胺濃度，用UV－5100紫外可見分光光度計測定吸光度，并繪制質量濃度與吸光度之間的標準曲線。

采用淀粉-碘化鎘方法測定聚丙烯酰胺生物降解前后的質量濃度，計算出選煤循環(huán)水中殘留聚丙烯酰胺的降解率（%），降解率的表達式為[15]：

式中：c0—生物降解前聚丙烯酰胺的質量濃度，mg/L；ct—生物降解后聚丙烯酰胺的質量濃度，mg/L。

1.2.5 聚丙烯酰胺復合降解菌種的生長和降解特性研究方法

試驗方法：利用實驗室模擬選煤循環(huán)水配制聚丙烯酰胺濃度為500 mg/L的降解培養(yǎng)液100 mL，接入體積比為2%的復合菌菌懸液，兩種菌懸液的添加量比例為1∶1。調節(jié)培養(yǎng)液的pH值為7，將培養(yǎng)液置于溫度為30℃、轉速為130 r/min的振蕩培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)10天；每天測定降解培養(yǎng)基中聚丙烯酰胺濃度的變化及細菌的生長量，并依降解曲線確定后續(xù)試驗適宜時間。

1.2.6 底物濃度對復合降解菌種生長和降解特性影響的研究方法

試驗方法：利用實驗室模擬選煤循環(huán)水配制聚丙烯酰胺濃度分別為 100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、1 000 mg/L的降解培養(yǎng)基，按2%的體積比接入復合降解菌懸液，兩種菌懸液的添加量比例為1∶1。調節(jié)培養(yǎng)液的pH值為7，將培養(yǎng)液置于振蕩培養(yǎng)箱，在溫度30℃、轉速130 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)至已確定的適宜時間；取樣測定降解培養(yǎng)液中聚丙烯酰胺濃度的變化及細菌的生長量，并依降解曲線確定復合降解菌株適宜聚丙烯酰胺的底物濃度范圍及最適底物濃度。

1.2.7 空白對照組的設置

以等底物濃度的無菌溶液作為對照組，以接種等體積的無菌水作為對照。在相同的培養(yǎng)環(huán)境下放置相同時間，取樣測定降解培養(yǎng)液中聚丙烯酰胺濃度的變化。

1.2.8 單菌種降解聚丙烯酰胺的研究方法

配制聚丙烯酰胺濃度為500 mg/L的降解培養(yǎng)基，以球紅假單胞菌與枯草芽孢桿菌分別作為降解菌，接入體積比為2%的菌液，按照復合菌種降解聚丙烯酰胺的最優(yōu)試驗條件進行降解培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7天，每天測定降解培養(yǎng)基中聚丙烯酰胺濃度的變化并繪制降解特性曲線，計算出培養(yǎng)階段的最高降解率。

1.2.9 復合降解菌種降解聚丙烯酰胺的正交試驗設計

查閱相關文獻可知，培養(yǎng)溫度、pH、菌液添加量等均對復合降解菌種的聚丙烯酰胺降解效果有一定影響[16-19]。采用正交試驗方法設計復合降解菌降解聚丙烯酰胺的試驗方案。采用L9（33）正交試驗設計，主要考查培養(yǎng)溫度、pH、菌液添加量對復合降解菌種的聚丙烯酰胺的降解效果。以聚丙烯酰胺的降解率作為試驗指標，試驗中不考慮各因素間的交互作用。接種的菌液采用培養(yǎng)兩天的菌液，正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 The factor level table of orthogonal experiment

2 結果與討論

2.1 聚丙烯酰胺復合降解菌的生長特性分析

根據測定的試驗數據繪制復合降解菌株的生長曲線和降解率曲線如圖1所示。

圖1 復合降解菌的生長及降解曲線Fig.1 Growth curve and degradation curve of composite strain

由圖1可知，培養(yǎng)過程中復合降解菌種的生長量和聚丙烯酰胺的降解率均呈現(xiàn)先逐漸升高而后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。在l～3 d為復合降解菌適應期，復合降解菌生長速度較慢，聚丙烯酰胺降解率變化較小；在3～5 d復合降解菌種開始進入生長對數期，菌種量迅速增加，聚丙烯酰胺降解率也迅速增大，一直持續(xù)到第7 d；7 d后菌種開始逐漸進入衰亡期，菌種量及聚丙烯酰胺的降解率均趨于一個較大的穩(wěn)定值。在降解培養(yǎng)的初期時間段內，降解菌種逐漸適應培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質充分，因此降解菌種迅速生長繁殖。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中的降解菌量不斷增多，但營養(yǎng)物質逐漸枯竭，會抑制甚至削減降解菌量，同時長時間的培養(yǎng)聚丙烯酰胺對生物菌種會顯現(xiàn)毒害作用，減弱降解菌種對聚丙烯酰胺的降解效果。綜合考慮降解周期及降解效果等因素，根據圖中復合降解菌種的生長曲線及聚丙烯酰胺降解率的變化情況，可確定在后續(xù)試驗中選取培養(yǎng)時間7 d作為菌種連續(xù)培養(yǎng)的最佳時間。

2.2 底物濃度對復合降解菌生長和降解特性的影響

根據測定的試驗數據繪制底物濃度對復合菌的生長量及降解率的影響變化曲線，見圖2。

圖2 底物濃度對復合菌種生長量和降解率的影響Fig.2 Effects of the substrate concentration on the growth and degradation rate of compound bacteria

從圖2可以看出，聚丙烯酰胺降解率及復合降解菌的生長量隨底物濃度的變化趨勢大致相同，均呈現(xiàn)開始逐步升高，達到一定數后又逐漸降低的變化趨勢。底物濃度在300～700 mg/L之間時，復合降解菌具有較高的生長量及聚丙烯酰胺降解率，在此濃度區(qū)間內復合菌的適應能力較好。分析可知，底物濃度的高低關系到培養(yǎng)基中碳源及氮源的高低，在低底物濃度的培養(yǎng)基中，降解菌種無法攝取到充足的氮源，影響復合降解菌的生長繁殖；在底物濃度高的降解培養(yǎng)中，降解菌種能夠充分攝取生長繁殖所需的碳源及氮源，但底物濃度過高時，聚丙烯酰胺對降解菌種會呈現(xiàn)生物毒性，影響降解菌種的生長繁殖及降解能力。結合底物濃度對降解及生長的影響曲線綜合考慮，培養(yǎng)基中復合降解菌的適宜聚丙烯酰胺濃度為300～700 mg/L，在后續(xù)試驗中選取聚丙烯酰胺濃度為500 mg/L作為最適底物濃度。

2.3 微生物及非生物絮凝劑對煤泥水絮體的助濾效果

將復合降解菌在滅菌后的降解培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7 d，根據測定的試驗數據整理后試驗結果見表2。

表2 復合降解菌降解試驗結果Tab.2 Experimental results of polyacrylamide degradation by compound bacteria

2.4 復合降解菌降解聚丙烯酰胺的正交試驗結果分析

根據試驗結果對試驗指標聚丙烯酰胺降解率進行分析，計算結果如表3。

表3 正交試驗均值響應表Tab.3 The mean response of orthogonal experimental

通過直觀分析[20]，確定了各試驗因素影響復合降解菌降解聚丙烯酰胺特性試驗結果的主次順序為A＞B＞C，培養(yǎng)溫度A3對試驗指標影響最大，其次是培養(yǎng)基初始pH值B2對試驗指標有較明顯影響，菌液添加量C2對試驗指標的影響較弱。由試驗結果分析可得，考查因素對試驗指標的影響順序為：A3＞B2＞C2。最優(yōu)因素水平為培養(yǎng)溫度為35℃，pH為7，菌液添加量為2 mL。在最優(yōu)條件下進行試驗時，復合降解菌對聚丙烯酰胺的降解率為39.24%。

2.5 空白對照組中聚丙烯酰胺自然降解結果與分析

將滅菌后的聚丙烯酰胺溶液連續(xù)培養(yǎng)10 d，根據測定的試驗數據繪制自發(fā)降解率曲線，如圖3所示。

圖3 空白對照組試驗Fig.3 Blank experimen

從圖3可以看出，在空白對照組中，聚丙烯酰胺的自然降解速度緩慢，連續(xù)培養(yǎng)7 d時聚丙烯酰胺的自發(fā)降解率為2.58%。此部分的降解主要是由于在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)時與容器碰撞發(fā)生了機械降解。自然環(huán)境中的聚丙烯酰胺自發(fā)降解率低且降解周期長。

2.6 單菌種降解聚丙烯酰胺的結果與分析

將球紅假單胞菌在滅菌后的降解培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7 d，根據測定的試驗數據繪制降解率曲線，如圖4所示。

圖4 球紅假單胞菌對聚丙烯酰胺的降解曲線Fig.4 Degradation curve of polyacrylamide by R.S

從圖4可以看出，在復合菌降解聚丙烯酰胺的最優(yōu)試驗條件下，連續(xù)降解培養(yǎng)7 d，球紅假單胞菌降解聚丙烯酰胺的最終降解率為24.9%。由此可以看出，球紅假單胞菌對聚丙烯酰胺有明顯的降解效果，但對聚丙烯酰胺的降解效果不如復合菌種。

將枯草芽孢桿菌在滅菌后的降解培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7 d，根據測定的試驗數據繪制降解率曲線，如圖5所示。

圖5 枯草芽孢桿菌對聚丙烯酰胺的降解曲線Fig.5 Degradation curve of polyacrylamide by Bacillus subtilis

從圖5可以看出，在復合菌降解聚丙烯酰胺的最優(yōu)試驗條件下，連續(xù)降解培養(yǎng)7 d，枯草芽孢桿菌降解聚丙烯酰胺的最終降解率為22.13%，可以看出枯草芽孢桿菌單獨降解聚丙烯酰胺時其降解效果明顯不如復合菌種對聚丙烯酰胺的降解力度。

3 結論

通過試驗研究與分析，可以得出如下結論：

（1）在復合降解菌種降解聚丙烯酰胺的正交試驗考查的因素水平中，各試驗因素對降解效果影響的主次順序為培養(yǎng)溫度＞pH值＞復合降解菌菌液添加量，其中，復合降解菌培養(yǎng)溫度對聚丙烯酰胺有顯著影響，pH值和復合降解菌菌液添加量對于試驗指標沒有顯著影響。復合降解菌降解聚丙烯酰胺特性的最優(yōu)因素水平組合為培養(yǎng)溫度為35℃，降解培養(yǎng)基初始pH值為7，菌液添加量為2 mL。

（2）微生物降解菌球紅假單胞菌和枯草芽孢桿菌均可有效地降解選煤循環(huán)水中殘留的聚丙烯酰胺，改變循環(huán)水中聚丙烯酰胺的濃度，分別添加時聚丙烯酰胺的降解率分別為24.9%、22.13%，自然降解的降解率為2.58%。

（3）微生物菌種球紅假單胞菌與枯草芽孢桿菌復合添加時的降解效果優(yōu)于單一添加微生物降解菌或自然降解的降解效果。最優(yōu)試驗條件下，球紅假單胞菌與枯草芽孢桿菌復合降解選煤循環(huán)水中殘留的聚丙烯酰胺，降解率為39.24%。

（4）微生物菌種在降解聚丙烯酰胺時，菌種在培養(yǎng)前期階段逐漸適應降解培養(yǎng)基環(huán)境，在此階段菌種生長較慢，降解率也不高；在菌種逐漸適應生長環(huán)境后，其繁殖速度加快，生長快速，對聚丙烯酰胺的降解率也逐漸增大；當菌種進入生長衰亡期時，菌種會大量死亡，聚丙烯酰胺的降解率甚至會減弱。