龔旭昊,張 璐,董玲玲,楊 星,范 強

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀 100081)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,是重要的補益中藥。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是黃芪中最重要的天然有效成分,具有增強免疫功能、提高巨噬細(xì)胞活性、抗過氧化、抗菌、抗病毒及抗腫瘤、預(yù)防衰老及抗輻射、雙向調(diào)節(jié)血糖等作用[1]。目前已作為免疫增強劑和抗病毒藥物廣泛應(yīng)用于畜禽業(yè)中,而黃芪多糖相關(guān)制劑也已成為動物藥業(yè)生產(chǎn)中首選的綠色獸藥品種[2]。因此,研究和開發(fā)新的黃芪多糖提取方法,對養(yǎng)殖業(yè)病毒性疾病的防治研究,以及黃芪多糖相關(guān)產(chǎn)品及產(chǎn)業(yè)的開發(fā)和發(fā)展均具有重要的實際意義。黃芪多糖有多種提取方法,每種提取方法也各有其優(yōu)缺點,為了更好地對其進(jìn)行應(yīng)用和開發(fā),文章對近年來黃芪多糖提取方法的研究文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述,以期能提供一定的參考價值。

1 水提取法

1.1 水煎煮法 水煎煮法為黃芪多糖傳統(tǒng)提取方法,又稱為水提醇沉法,其是根據(jù)大多數(shù)多糖在熱水中溶解度較大而在高濃度醇中溶解度小的性質(zhì)進(jìn)行提取。一般工藝流程為加8～12倍量水,煎煮2～3次,每次1～2 h,過濾,合并濾液,再經(jīng)濃縮、醇沉等處理得到黃芪粗多糖。該方法的優(yōu)點是工藝簡單、操作方便、對多糖的破壞小,是目前應(yīng)用最為廣泛的黃芪多糖提取方法。徐青梅[3]對工藝進(jìn)行了優(yōu)化,最佳工藝條件為提取溫度100℃,時間1 h,提取3次。李金芳[4]確定的最佳提取工藝為：提取時間45 min、提取溫度100℃、料液比1∶10、提取次數(shù)3次,多糖提取率為10.35%。

雖然該方法簡單易行,但也存在一些缺點：(1)多糖提取率及含量普遍較低；(2)提取溫度高(100℃),且需要耗費大量有機溶劑,浪費能源和資源,經(jīng)濟效益較低；⑶對提取物的選擇性不好,提取物成分類別較多,不利于后續(xù)的分離純化,同時也容易變質(zhì)。

1.2 水浸提法 采取水浸提法提取黃芪多糖,降低了提取溫度,不但節(jié)約了能源消耗,提高了經(jīng)濟效益,而且可以提高提取的選擇性及提取物的純度。郝穎等[5]采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪多糖的提取工藝,浸提溫度95℃、浸提時間156 min、液料比29 mL/g、提取4次,在此條件下黃芪多糖的得率為13.20%,與預(yù)測值極為接近,工藝可靠。相較于傳統(tǒng)水煎煮法,水浸提法更加環(huán)保、成本較低且適合生產(chǎn)。

1.3 水回流提取法 崔紅花等[6]篩選出回流提取黃芪多糖的最佳提取工藝為：70℃恒溫回流提取3次,每次3 h,固液比1∶40,黃芪多糖提取率達(dá)6.037%。劉楊等[7]回流提取的最佳工藝為：料液比1∶20；醇沉濃度 70%；回流提取 3次,每次50 min。

和傳統(tǒng)水煎煮法相比,水回流提取法更加環(huán)保,節(jié)約資源,而且提取過程更為充分。

1.4 堿水提取法 黃芪多糖存在于黃芪纖維質(zhì)中,因此其提取率和纖維質(zhì)的溶脹作用及溶解性有著直接相關(guān)關(guān)系。在堿性條件下,一方面可使纖維的溶脹作用及溶解性得到顯著增加,另一方面可使纖維之間的酯鍵更易發(fā)生斷裂而發(fā)生剝皮反應(yīng),進(jìn)而使更多的多糖以游離形式而被提取出來,進(jìn)而提高多糖的提取率。劉永錄等[8]采用NaOH水溶液提取法：取黃芪藥材400 g,分別加12和10倍量pH值為12的NaOH水溶液煎煮2次,經(jīng)后續(xù)處理,黃芪多糖提取率為7.73%,高于同試驗進(jìn)行的Ca(OH)2溶液提取率(7.12%),顯著高于傳統(tǒng)水提法提取率(3.64%)。另文作者還對不同pH值的CaO溶液提取黃芪多糖的效果進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)pH值為9時,所得黃芪多糖提取率和純度最高。

綜述相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),堿水提取黃芪多糖多采用弱堿或稀堿溶液(pH值多為9～10),是為了避免強堿對多糖結(jié)構(gòu)造成不良影響。雖然堿水提取法在提取率、產(chǎn)品純度及經(jīng)濟效益方面都優(yōu)于傳統(tǒng)水提法,但該法提取過程所得濾液不易過濾和濃縮,一定程度上限制了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1.5 醇除水提法許多學(xué)者對黃芪多糖前處理工藝進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),通過對原料黃芪進(jìn)行化學(xué)處理或生物學(xué)處理可顯著提高多糖收率。而化學(xué)處理多為選用有機溶劑進(jìn)行脫脂處理,以減少提取液中雜質(zhì)含量?？紤]到脫脂溶劑的毒性及可操作性,目前多采用高濃度乙醇脫脂。牟魯霞等[9]采用3倍量95%乙醇對黃芪藥材回流脫脂1.5 h后,加入8倍量水,在100℃下提取90 min,共提取3次,粗多糖提取率和以葡萄糖計的多糖得率平均為14.76%,4.78%。

醇除水提法已經(jīng)深入結(jié)合到多數(shù)黃芪多糖提取方法中,即多數(shù)方法均先用高濃度乙醇溶液(80% ～95%)除去部分雜質(zhì)后,再進(jìn)行黃芪多糖的提取,以便于多糖后續(xù)的分離純化等處理,使得到的產(chǎn)物純度更高。

2 堿醇提取法

在堿水提取黃芪多糖的工藝基礎(chǔ)上繼續(xù)改進(jìn),采用堿醇提取,主要是基于堿溶液對植物細(xì)胞具有明顯破壁作用,對植物纖維有明顯溶脹及溶解作用,而醇溶液則有很強的滲透作用,在醇與堿的共同作用下,可以增加黃芪多糖的滲透率,降低多糖在植物組織中的殘留量,從而達(dá)到提高提取率的目的。

田洛等[10]首次采用堿醇法提取黃芪多糖,篩選出黃芪多糖的最佳提取工藝,料液比1∶10,pH值=12的5%Na2CO3乙醇溶液,90℃提取90 min,多糖提取率為19.15%,高于本試驗同樣條件下堿水提取法(7.31%)、水提取法(5.47%)及相關(guān)文獻(xiàn)報道的黃芪多糖的提取率,且提取殘渣中有效成分含量較低,具有現(xiàn)實生產(chǎn)意義。金芬芬等[11]通過試驗比較水提醇沉法、醇提后水提法、堿水提取法、堿醇提取法的提取效果,研究發(fā)現(xiàn),4種提取方法中堿醇提取法提取率最高(9.74%),其后依次為堿水提取法(7.64%)、醇提后水提法(3.62%)、水提醇沉法(2.81%)。堿醇提取工藝為 pH值 =12的NaOH醇溶液,料液比1∶10,加熱回流提取3次,時間分別為3 h、2.5 h、2 h。

該方法是一種基本實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的方法,較傳統(tǒng)提取方法,其多糖提取率較高,產(chǎn)品純度及穩(wěn)定性也較好。但該法對生產(chǎn)設(shè)備的要求相對較高,而且提取過程中產(chǎn)生的廢水需要處理,進(jìn)而增加了能源消耗。

3 微波提取法

微波具有穿透力強、選擇性高、提取時間短、加熱效率高等特點。微波提取法又稱微波輔助提取技術(shù),是一種將傳統(tǒng)溶劑提取與微波結(jié)合而形成的提取方法,該技術(shù)于1986年首次用于有機物的提取[12]。在黃芪多糖的提取研究中采用微波進(jìn)行輔助提取主要是基于微波的快速熱效應(yīng)能使細(xì)胞壁破裂,并使細(xì)胞膜中的酶失去活性,從而使細(xì)胞中的多糖成分更容易被提取出來,進(jìn)而達(dá)到提高提取率的目的。

王莉等[13]首次采用微波技術(shù)提取黃芪多糖,將黃芪藥材放于連續(xù)微波反應(yīng)器中,通過有機溶劑脫脂、不斷調(diào)整機器功率、以水回流提取等方式制備黃芪多糖,大大縮短了提取時間,同時也提高了多糖含量(6.55%),但對所得多糖的結(jié)構(gòu)組成及結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化未作研究。陳玉霞等[14]通過比較微波提取和水提醇沉法制備黃芪多糖的實驗研究發(fā)現(xiàn),微波提取法的黃芪多糖提取率為4.502%,含量為31.25%,均高于水提醇沉法的4.468%和29.40%。微波提取有著更高的提取率和多糖含量。

微波輔助提取縮短了提取時間,降低了溶劑損耗,較水提取法提取率有了明顯提高。但是設(shè)備可操作性差,對提取物的選擇性差,產(chǎn)品純度相對較低,易變質(zhì),不易于后續(xù)處理。此外,微波是否會對黃芪多糖的結(jié)構(gòu)、生物活性甚至藥效等產(chǎn)生影響還有待深入研究。

4 超聲提取法

作為一種新型的多糖提取技術(shù),超聲波提取黃芪多糖的原理主要基于以下兩個方面[15]：(1)超聲波處理加速了黃芪藥材的溶脹及水合過程,有利于多糖通過滲透及擴散作用更快的轉(zhuǎn)移到提取溶劑中；(2)超聲波的空化作用可以破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),有利于胞內(nèi)多糖的快速溶出。

陳壽妮[16]通過4因素3水平的正交試驗設(shè)計,確定超聲提取的最優(yōu)工藝為超聲功率300 W,溫度50℃,料液比1∶30,提取4次。所建立的方法快速簡便,適用于黃芪多糖的提取。趙玉叢等[17]比較循環(huán)超聲法和煎煮法提取黃芪多糖的區(qū)別,當(dāng)提取時間40 min,提取功率1000 W,超聲時間/間隙時間比值=1∶1時,多糖提取率最高可達(dá)11.44%,比傳統(tǒng)煎煮法高3.38%。研究還通過傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)技術(shù)對兩種提取法制得的黃芪多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)超聲提取會引起黃芪多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化,煎煮法對多糖結(jié)構(gòu)沒有明顯破壞。分析其原因在于超聲波會引起化學(xué)鍵斷裂和原子重排,進(jìn)而導(dǎo)致組成多糖的單糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,而分子結(jié)構(gòu)的改變,也可能會對多糖的理化性質(zhì)及生物活性產(chǎn)生一定影響。

與傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波提取黃芪多糖具有提取率高、省時、節(jié)能、節(jié)省溶劑等優(yōu)點,降低了提取成本。但該方法也有其局限性,一方面是所得多糖粗提物的總量少,且后續(xù)提取及藥渣處理比較復(fù)雜；另一方面,其對黃芪多糖結(jié)構(gòu)及生物活性的影響尚具不確定性,這也導(dǎo)致該方法在實際應(yīng)用中沒有得到大范圍的推廣。

5 超高壓提取法

超高壓提取技術(shù)是一種全新的天然產(chǎn)物有效成分提取技術(shù),是指在常溫下用100～1 000 MPa的流體靜壓力作用于料液上,保壓一段時間后,迅速卸壓,使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力差突然增大,破壞細(xì)胞的各種膜,進(jìn)而達(dá)到提取的目的。此外,由于超高壓提取是在常溫下進(jìn)行的,所以在提取黃芪多糖時,還可有效避免熱效應(yīng)導(dǎo)致其生物活性降低的問題。

劉春娟等[17]首次采用超高壓技術(shù)提取黃芪多糖,其條件為：壓力350 MPa,料液比1∶60,浸泡時間5 h,保壓時間2 min,多糖提取率為24.28%。王再幸等[18]采用高壓脈沖電場快速提取黃芪多糖,確立的最佳工藝為電場強度20 KV/cm,脈沖數(shù)為6,料液比1∶14,最終黃芪多糖得率為24.36%。

超高壓提取法與傳統(tǒng)提取方法相比,提取率得到明顯提高,且具有時間短、耗能低、提取液雜質(zhì)少、易分離純化等優(yōu)點,但一方面其對生產(chǎn)設(shè)備的要求相對較高,另一方面研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖的低溫提取物重復(fù)藥效并不好。該方法有待進(jìn)一步的深入研究。

6 酶提取法

酶提取技術(shù)是近年來應(yīng)用愈加廣泛的一種植物有效成分提取的生物工程技術(shù),其主要是利用酶具有催化效率高、專一性強、作用條件溫和等特點,將植物組織分解,加速有效成分的釋放,進(jìn)而提高提取率。中草藥植物細(xì)胞壁大多由纖維素構(gòu)成,黃芪藥材中纖維素和半纖維素分別占25.63%、12.18%,二者共占了原料成分的37.81%,而經(jīng)傳統(tǒng)提取工藝提取過的藥渣中主要是結(jié)構(gòu)多糖且以纖維素含量最多?？紤]到纖維素對黃芪多糖最大限度的溶出具有較大制約作用,且纖維素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成,而纖維素酶能特異性的破壞β-1,4糖苷鍵,并且具有很高的穿透性,能進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)部將其充分溶脹,在不破壞多糖成分的前提下將其充分溶出,進(jìn)而提高提取率[19]?；诖?多選用纖維素酶作為黃芪多糖的輔助提取用酶。

閆巧娟等[20]首次將纖維素酶輔助提取工藝應(yīng)用于黃芪多糖的提取,在對多糖含量影響不大的情況下,黃芪多糖得率的提高率達(dá)20%以上。纖維素酶的最佳處理條件為：加酶量60 U/g,酶處理時間90 min,處理溫度50℃。通過掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)纖維素酶處理后的藥渣中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得十分清晰,中間的多糖等物質(zhì)得到了較為充分的溶出。張嘉怡等[21]報道酶添加量0.4%,酶解pH值4.2,酶解溫度55℃,酶解時間90 min；水提溫度100℃,水提時間1.5 h,料液比1∶12,提取3次。黃芪多糖提取率較傳統(tǒng)水提法提高了54.05%。

研究發(fā)現(xiàn),纖維素酶不改變提取傳質(zhì)動力學(xué),僅破壞黃芪藥材細(xì)胞壁,降低擴散阻力,使黃芪多糖的傳質(zhì)速率和有效擴散系數(shù)明顯提高[22]。因此,酶法提取黃芪多糖,能減少提取時間,降低能源損耗,提高提取率,增強產(chǎn)品穩(wěn)定性,且對環(huán)境無污染,具有非常廣闊的發(fā)展前景。

7 聯(lián)合提取及其他新方法

董玲玲等[23]采用纖維素酶酶解-微波法新工藝提取黃芪多糖,確立的最佳工藝條件為：酶料比57.6 U/g,pH值6.0,60℃下酶解60 min,料液比1∶10,微波功率480 W,提取2次,8 min/次,所得多糖提取率為16.07%,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)88.40%。優(yōu)于文獻(xiàn)報道的提取效果,且該方法具有耗時短、能耗低、提取率高、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點,是一種較為理想的提取方法。杜廣芬等[24]采用超聲-微波聯(lián)合提取工藝提取黃芪多糖,最佳提取條件為微波功率120 W,提取時間為150 s,料液比1∶25,黃芪多糖的提取率高于水提法、微波法及超聲波法。賁永光等[25]采用超聲聯(lián)合纖維素酶法提取黃芪多糖,最佳工藝參數(shù)為：超聲功率400 W,時間30 min,溫度40℃,料液比1∶20,加酶量10 mg,酶解溫度50℃,pH值4.5,酶解時間60 min。所得多糖的平均提取率為24.12%,工藝穩(wěn)定可行。陳艷蕊[26]等建立了黃芪多糖的閃式提取技術(shù)工藝,提取溫度65℃、提取時間2 min、pH 值為10、提取電機電壓200 V、料液比1∶10、乙醇濃度為5%(V/V),所得黃芪多糖總量達(dá)到123.46 mg/g,比堿提法多糖得率提高了近30%。

研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),一些聯(lián)合提取方法及其他一些新工藝,提取黃芪多糖的效率更高,值得進(jìn)一步深入研究。

8 思考與展望

隨著科技的進(jìn)步和研究的深入,黃芪多糖的提取方法愈加豐富多彩,亦取得了很多的成果和突破。但每種方法都不是十全十美的,都有其優(yōu)缺點,而評價一個提取方法是否優(yōu)良,筆者認(rèn)為可以從以下幾個方面進(jìn)行綜合考慮：⑴黃芪多糖的提取率及純度高低；⑵是否有利于多糖后續(xù)的分離純化等處理；⑶提取工藝是否穩(wěn)定可靠、簡單方便、經(jīng)濟環(huán)保；⑷是否會對多糖的結(jié)構(gòu)、生物活性及臨床藥效產(chǎn)生不利影響；⑸提取工藝用于實際生產(chǎn)的可行性及對生產(chǎn)設(shè)備和條件要求的高低。目前,水提取法仍是應(yīng)用最多的一種方法,其工藝成本低、安全,適于工業(yè)化大生產(chǎn),但較其他方法提取率相對較低,對提取物的選擇性不好,產(chǎn)品純度低、易變質(zhì),不利于后續(xù)的處理。堿醇提取法成本低、時間短、條件溫和、提取率高,具有實際生產(chǎn)意義?，F(xiàn)代提取方法,如微波、超聲及超高壓提取等,雖然總體上有更高的提取率,但因其對黃芪多糖結(jié)構(gòu)和生理活性的影響具有不確定性及對生產(chǎn)設(shè)備的要求比較復(fù)雜等,一定程度上限制了它們在生產(chǎn)上大規(guī)模的應(yīng)用。而纖維素酶提取法具有條件溫和、節(jié)能環(huán)保,提取選擇性高、省時、產(chǎn)品穩(wěn)定等優(yōu)點,經(jīng)分析文獻(xiàn)研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)其提取率較傳統(tǒng)提取方法高出近2倍以上,經(jīng)濟效益較高,值得進(jìn)一步深入研究和在實際生產(chǎn)中大力推廣應(yīng)用。

在綜述文獻(xiàn)時還發(fā)現(xiàn),即便采用類似的或同一種提取方法,所得黃芪多糖提取率均有差異,有時差異甚至較大。這可能與研究人員所選用的黃芪藥材品種、質(zhì)量、所用溶劑的量及濃度、提取時間、溫度、次數(shù)等具體技術(shù)參數(shù)有關(guān)。因此,若要得到更加穩(wěn)定的工藝及結(jié)果,需要對提取過程中的諸多影響因素進(jìn)行綜合考慮并嚴(yán)格控制,建議制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)加以規(guī)范。

為黃芪多糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供更加優(yōu)質(zhì)、高效、經(jīng)濟、環(huán)保的原料是黃芪多糖提取方法研究的最終目的。雖然截止到目前,一些提取方法尤其是現(xiàn)代提取方法對黃芪多糖結(jié)構(gòu)變化、穩(wěn)定性、生理活性、成分組成及臨床藥效的影響有些還尚不清楚,還有待于進(jìn)一步深入的研究。但我們相信隨著技術(shù)的進(jìn)步及研究的不斷深入,已有工藝會不斷得到優(yōu)化,新技術(shù)亦會逐漸彌補已有工藝中的不足,新的更好的方法也會不斷的被開發(fā)出來,進(jìn)而對黃芪多糖相關(guān)產(chǎn)品及產(chǎn)業(yè)的開發(fā)和發(fā)展產(chǎn)生積極的促進(jìn)意義。