金舒文，王佳

（浙江大學奶業(yè)科學研究所，浙江杭州 310058）

反芻動物瘤胃甲烷排放占全球甲烷排放量的13%～19%[1]，是甲烷的重要生物來源。瘤胃中甲烷的生成既降低了消化能到代謝能的轉(zhuǎn)化率，造成能量的損耗和資源的浪費，又增加了大氣中的溫室氣體，污染環(huán)境。產(chǎn)甲烷菌主要有3種營養(yǎng)類型：氫營養(yǎng)型、甲基營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型。氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌通過氧化氫，還原二氧化碳生成甲烷。甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用甲基化合物如甲醇、甲胺、二甲基硫化物生成甲烷。乙酸型產(chǎn)甲烷菌利用乙酸生成甲烷。在反芻動物瘤胃內(nèi)，82%的甲烷由第一種營養(yǎng)途徑生成[2]。產(chǎn)甲烷菌利用氫氣生成甲烷的同時，降低了瘤胃內(nèi)的氫分壓，保障了瘤胃中其他微生物發(fā)酵的順利進行。產(chǎn)甲烷菌與原蟲、細菌、真菌間的種間氫傳遞是其高效獲取氫氣的基礎(chǔ)，也是調(diào)控瘤胃微生態(tài)進行甲烷減排的關(guān)鍵。抑殺原蟲和產(chǎn)氫細菌、競爭性結(jié)合氫 、阻斷氫生成甲烷是通過氫調(diào)控減少瘤胃甲烷生成的主要手段。瘤胃微生物互作直接影響氫調(diào)控的效果。為此，本文在綜述了產(chǎn)甲烷菌與其他瘤胃微生物間的種間氫傳遞方式及基于氫調(diào)控的瘤胃降甲烷途徑的基礎(chǔ)上，探討了瘤胃微生物整體化調(diào)控的可行性。

1 產(chǎn)甲烷菌與其他瘤胃微生物間的種間氫傳遞

1.1 原蟲與產(chǎn)甲烷菌的選擇性共生 大多數(shù)瘤胃原生動物具有氫化酶體，這是一種雙層膜包裹的簡單細胞器，內(nèi)含氫化酶。蘋果酸在氫化酶作用下脫羧產(chǎn)生ATP、氫氣、二氧化碳和乙酸，提升厭氧情況下的供能效率[3-4]，氫化酶體可以誘發(fā)一些產(chǎn)甲烷菌成為原蟲共生菌[5]。Valle等[6]借助激光共聚焦掃描顯微鏡，觀測產(chǎn)甲烷菌特異性輔酶F20的自發(fā)性熒光，證實產(chǎn)甲烷菌的原蟲細胞內(nèi)共生與細胞外共生形式同時存在，且產(chǎn)甲烷菌能夠整合到原蟲的生物膜上。Ng等[7]基于基因組數(shù)據(jù)，利用噬菌體展示技術(shù)從產(chǎn)甲烷菌Methanobrevibacter ruminantium M1中鑒定出一種可以廣譜黏附于瘤胃原生動物生物膜上的蛋白質(zhì)（Mru_1499），為產(chǎn)甲烷菌與原生動物的共生模式提供了有力支持。原生動物胞內(nèi)或者胞外共生的產(chǎn)甲烷菌被稱為原生動物相關(guān)甲烷菌（Protozoan Associated Methanogens，PAM）。Belanche等[8]利用終端限制性片段長度多態(tài)性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorp-hism，T-RFLP）分析瘤胃中的PAM，結(jié)果顯示，PAM與瘤胃中游離的產(chǎn)甲烷菌具有不同的群落結(jié)構(gòu)，說明在原蟲與PAM的共生關(guān)系中，原蟲對于PAM具有一定的“選擇”作用；全毛目原生動物中內(nèi)共生的產(chǎn)甲烷菌與總原生動物中內(nèi)共生的產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)亦顯著不同，說明不同的原蟲存在不同的PAM結(jié)構(gòu)，即產(chǎn)甲烷菌對于原蟲亦存在一定的“選擇”作用。這與Regensbogenova等[9]體外純培養(yǎng)的Entodinium furca 、有尾頭毛蟲（Ophryoscolex caudatus）、具齒雙毛蟲（Diplodinium dentatum） 3種原生動物具有不同的PAM結(jié)果一致。Xia等[10]利用熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)，在單細胞水平探究肉牛瘤胃中內(nèi)毛蟲屬原生動物和產(chǎn)甲烷菌的共生關(guān)系，發(fā)現(xiàn)飼喂含苜蓿干草與黑麥秸稈不同日糧的情況下，內(nèi)毛蟲屬原生動物的PAM結(jié)構(gòu)相似，說明瘤胃中原蟲與產(chǎn)甲烷菌的共生關(guān)系的選擇作用不受日糧影響，瘤胃中原蟲與產(chǎn)甲烷菌存在共生關(guān)系已經(jīng)是共識，然而不同原蟲的PAM結(jié)構(gòu)特異性尚不明確，瘤胃原生動物與產(chǎn)甲烷菌的互選機制有待進一步研究。

1.2 粘附素樣蛋白增加產(chǎn)甲烷菌與細菌的黏附和聚攏 嗜熱丙酸氧化菌（Pelotomaculum thermopropionicum strain SI）與 嗜熱自養(yǎng)甲烷菌（Methanothermobacter thermaut-otrophicus strain ΔH）在丙酸鹽底物培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時，表現(xiàn)出空間上的聚攏現(xiàn)象，顯微鏡觀察到胞外聚合物結(jié)構(gòu)，且嗜熱丙酸氧化菌細胞的鞭毛樣細絲在相互作用中起作用[11]。反芻動物甲烷短桿菌M1（Methanobrevibacter ruminantium M1）與瘤胃產(chǎn)氫丁酸弧菌（Butyrivibrio proteoclasticus B316 ）共培養(yǎng)時，2種細胞聚集，6個黏附素樣蛋白編碼基因在反芻動物甲烷短桿菌M1中被上調(diào)[12]。瘤胃細菌與產(chǎn)甲烷菌之間不是以共生的形式，而是以黏附和聚攏的形式提高氫傳遞的效率。

1.3 產(chǎn)甲烷菌改變真菌代謝途徑提高纖維降解效率 與單純真菌培養(yǎng)物相比，瘤胃真菌-產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)物表現(xiàn)出高纖維降解能力和高多糖水解酶酶活[13]。厭氧真菌也存在氫化酶體，產(chǎn)甲烷菌能通過去除厭氧真菌氫化酶體中丙酮酸分解積累的甲酸和氫，增強氫化酶體中的乙酸通路，同時減少細胞質(zhì)基質(zhì)中的乳酸通路，達到促進底物分解、增加能量生成的作用[14]。目前未見真菌與產(chǎn)甲烷菌共生的報道，瘤胃真菌和產(chǎn)甲烷菌間應(yīng)該通過特異性的伴生關(guān)系[15-16]提高氫傳遞的效率。

2 基于氫調(diào)控的瘤胃降甲烷途徑

2.1 抑殺原蟲和產(chǎn)氫細菌 脂質(zhì)[17]和單寧[18-19]、皂甙[20]、精油[21]等植物提取物都有抑殺原蟲和降甲烷的作用，效果與其來源有關(guān)。在奶牛日糧中加入粉碎的油菜籽可在不影響采食量的情況下有效降低甲烷排放量，而葵花籽和亞麻籽的甲烷減排作用以減少采食量為代價[17]。綿羊飼糧中直接添加含有單寧的合歡葉片、百脈根或者冠狀巖黃芪，瘤胃中原蟲數(shù)量甚至隨著單寧有效添加量的增加而線性增加[22-23]，而從各類植物中提純得到的單寧則顯著降低了原蟲數(shù)量[18-19,24]，且分子縮合程度越高，抑殺原蟲降甲烷效果越好。皂甙降甲烷效果的薈萃分析結(jié)果表明，提取于絲蘭的皂甙降甲烷效果最佳，茶次之，皂樹最弱[25]。與單寧和皂甙相比，精油的種類最為豐富，但其中大部分仍然停留在體外試驗階段，百里香油、肉桂油、柑橘油經(jīng)體外證實能夠在不影響生產(chǎn)性能的情況下減少甲烷排放量[26-27]。植物次生代謝物由于來源廣泛、安全，是理想的降甲烷物質(zhì)，但體內(nèi)試驗呈現(xiàn)出不一致的結(jié)果。Pathak等[28]通過無花果和番石榴葉粉，給羔羊補喂占日糧干物質(zhì)1%～2%的聚合單寧，發(fā)現(xiàn)補喂單寧可顯著提高羔羊的氮代謝、生長性能、羊毛產(chǎn)量、飼料轉(zhuǎn)化率，并且降低甲烷排放量。但Beauchemin等[29]使用占日糧干物質(zhì)1%～2%的商品單寧（白堅木提取物）飼喂安格斯牛，發(fā)現(xiàn)試驗組牛的日增重、飼料消化率和甲烷產(chǎn)量均沒有顯著變化，只有蛋白質(zhì)表觀消化率顯著降低。導致甲烷減排效果不一致的因素很多，包括添加劑量、動物品種、日糧等，體內(nèi)外試驗結(jié)果不一致亦表明瘤胃微生態(tài)的復(fù)雜性，以及微生物的調(diào)控手段需要進一步優(yōu)化。有研究使用莫能菌素[30]和細菌素[31]等可改善瘤胃微生物代謝，抑殺產(chǎn)氫細菌，但體內(nèi)試驗表明莫能菌素不能抑制所有的革蘭氏陽性菌群，而僅對細菌種群產(chǎn)生細微影響，且降甲烷效果在飼喂幾周后即消失[32]。

抑殺產(chǎn)氫細菌難度較大且效果不佳，而原蟲和產(chǎn)甲烷菌之間密切的共生關(guān)系使抑殺原蟲成為研究熱點之一。抑殺原蟲的方法多樣，其中植物次生代謝物表現(xiàn)出巨大潛力，但適宜添加劑量難以確定，實際降甲烷效果不穩(wěn)定。

2.2 競爭性結(jié)合氫 硝基化合物可以在瘤胃中競爭結(jié)合氫生成氨，在體外發(fā)酵試驗中降低甲烷排放量達92%，但硝酸鹽和硝基化合物在代謝過程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽和乙胺具有毒副作用，限制了其應(yīng)用[33]。鹵代脂肪烴也可以作為末端電子受體競爭性結(jié)合氫起到降甲烷作用，如溴氯甲烷在體內(nèi)試驗中降低肉牛甲烷排放50%～60%[34]，但鹵代烴的降甲烷作用存在適應(yīng)性[35]。鹵代脂肪烴對于大氣的污染和不可忽視的生物毒性也限制了其在畜牧業(yè)上的應(yīng)用。而藻類中含有有機鹵化物，Machado等[36]以肉牛瘤胃液為材料，針對20種藻類進行的體外產(chǎn)氣試驗表明，底物中添加這20種藻類均能降低甲烷產(chǎn)量，其中網(wǎng)地藻屬和海門東屬分別降低甲烷產(chǎn)量達92.2%和98.9%。由于地球表面水域面積廣闊，藻類生長迅速，是再生周期短且儲量豐富的生物資源，因此可以作為潛在的環(huán)保型飼料來源，用于瘤胃甲烷減排。

2.3 阻斷氫生成甲烷 了解甲烷生成途徑的生化機理之后，可以通過調(diào)控關(guān)鍵途徑的酶活性，阻斷甲烷的生成。其中最引人注目的是3-硝基酯-1-丙醇（3-nitrooxypropanol，3-NOP）的瘤胃降甲烷作用。Hristov等[37]的體內(nèi)試驗表明，飼喂60 mg/kg日糧（干重）添加量的3-NOP就能降低泌乳期荷斯坦奶牛甲烷排放量30%左右，持續(xù)飼喂12周仍未出現(xiàn)適應(yīng)性，且對瘤胃發(fā)酵水平和泌乳性能沒有影響。Romero-Perez等[38]以2 g/d的添加量飼喂肉牛3-NOP，持續(xù)128 d，發(fā)現(xiàn)甲烷生成持續(xù)減少，沒有產(chǎn)生適應(yīng)性，停止添加3-NOP后，降甲烷作用隨之消失。Duin等[39]在體內(nèi)、體外試驗的基礎(chǔ)上，利用計算機分子建模模擬配體-受體對接，提出3-NOP降甲烷的原理可能是3-NOP與甲基輔酶M還原酶競爭性結(jié)合，氧化其活性部位Ni（I）后使甲基輔酶M還原酶失活?？b密而持久的體內(nèi)試驗證實了3-NOP的降甲烷效果，排除了對生產(chǎn)性能的不利影響，進一步的機理探究使人們對3-NOP的了解更為完整，為實際大規(guī)模使用提供鋪墊，應(yīng)用前景廣闊。

3 瘤胃微生物的整體化調(diào)控

3.1 維持瘤胃微生物群落功能 瘤胃微生物群落是一個復(fù)雜的整體，反芻動物瘤胃對于粗飼料的高效分解是在細菌、真菌、古菌、原蟲等微生物互相“協(xié)作”下完成。產(chǎn)甲烷菌與其他瘤胃微生物之間復(fù)雜的種間氫傳遞是瘤胃微生物互作中重要的一環(huán)，因此當使用降甲烷添加劑時，即使僅是抑制產(chǎn)甲烷菌或者原蟲，由于破壞了原本微生物群落的平衡，往往會對瘤胃的發(fā)酵能力產(chǎn)生負面影響，繼而影響到動物的生產(chǎn)性能。控制添加劑量能夠減弱或者消除降甲烷添加劑對于反芻動物瘤胃發(fā)酵性能的不利影響，但甲烷抑制效果也將隨之減弱，而且氫調(diào)控添加劑的作用與動物種類和飼糧等有關(guān)，造成了實際生產(chǎn)中操作的困難[40]。多種添加劑聯(lián)用是能兼顧瘤胃微生物群落功能的解決途徑之一。硝酸鹽既是電子受體又能直接抑制產(chǎn)甲烷菌，從而起到顯著的降甲烷作用[41]，然而隨著日糧中硝酸鹽濃度增加，荷斯坦奶牛的采食量和產(chǎn)奶量都呈線性下降[42]。而較低劑量的硝酸鹽和抑殺原蟲的皂甙（硝酸鹽5 mmol/L、皂甙0.6 g/L）聯(lián)用時，能夠顯著降低甲烷排放量，同時增加了飼料降解率和總揮發(fā)性脂肪酸含量，降低了產(chǎn)甲烷菌豐度[43]。皂甙雖然有明顯的降甲烷作用，然而適口性差，不宜添加過多，硝酸鹽和皂甙聯(lián)用能緩解這一問題。Patra等[44]進一步通過體外試驗評價了皂甙、硝酸鹽和大蒜油這3種不同氫調(diào)控機制的添加劑在高精飼料和高粗飼料底物下的聯(lián)用效果，結(jié)果表明皂甙、硝酸鹽和大蒜油單獨使用時，降甲烷效率受飼料底物影響較大，但聯(lián)用時效果較為穩(wěn)定。這一結(jié)果表明，多種氫調(diào)控機制的添加劑聯(lián)用能夠得到更為穩(wěn)定的效果，或許能夠降低生產(chǎn)應(yīng)用中的風險，具有實際應(yīng)用價值。另一種思路是對幼齡反芻動物瘤胃進行早期調(diào)控，通過影響微生物定植過程，塑造一個甲烷排放量少的瘤胃微生物群落。Abecia等[45]的雙胞胎試驗中，連續(xù)飼喂分娩母羊溴氯甲烷2個月及其初生羔羊3個月，能改變羔羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌菌群，顯著降低羔羊的瘤胃甲烷排放量，降甲烷效果持續(xù)到6月齡之后依然沒有消失，而僅對羔羊或者僅對母羊飼喂溴氯甲烷則無降低甲烷排放效果。Lyons等[46]發(fā)現(xiàn)，早期飼喂亞麻籽油能影響羔羊瘤胃古菌和細菌定植，但Saro等[47]使用大蒜精油和亞麻籽油混合物對初生羔羊及其母羊進行調(diào)控時，發(fā)現(xiàn)停止飼喂后降甲烷作用消失，因此早期干預(yù)的效果或許與調(diào)控劑有關(guān)。早期干預(yù)在降低負面調(diào)控風險的同時減少投入成本，但是其降甲烷作用缺乏更長時間的觀測，且尚無評估早期瘤胃降甲烷氫調(diào)控對于生產(chǎn)性能影響的報道，有待進一步研究。

3.2 維持瘤胃微生物群落動態(tài)平衡 諸多氫調(diào)控劑的降甲烷效果在持續(xù)的生產(chǎn)試驗中表現(xiàn)出隨時間衰減，即瘤胃微生物對氫調(diào)控劑存在適應(yīng)性。瘤胃微生物群落作為一個有機的整體，是動態(tài)發(fā)展的，受到外界干預(yù)時將作出應(yīng)答，一段時間后微生物群落又達到某個平衡狀態(tài)，因此為了追求持續(xù)有效的降甲烷效果，需要避免適應(yīng)性的產(chǎn)生。植物次生代謝物中的皂甙、單寧、精油等均表現(xiàn)出降甲烷作用的衰減，在適宜用于動物的低劑量時衰減效果尤甚[48]。間歇性飼喂有降低瘤胃微生物對降甲烷添加劑適應(yīng)性的趨勢。精油具有廣譜殺菌作用，當飼喂植物精油時，早期由于精油對于原生動物和產(chǎn)甲烷菌的抑殺作用，甲烷產(chǎn)量能夠出現(xiàn)下降，但當原蟲和產(chǎn)甲烷菌對精油出現(xiàn)適應(yīng)性，降甲烷作用將逐漸消失，Wu等[27]的體內(nèi)試驗表明，間歇性飼喂植物精油能緩解湖羊瘤胃的這種適應(yīng)性，是潛在的有效降甲烷途徑。而3-NOP在長期的體內(nèi)試驗中均未出現(xiàn)適應(yīng)性，或許與飼喂后細菌和原蟲的數(shù)量均未受到影響、微生物群落平衡未被打破有關(guān)[49-50]。只有經(jīng)過長期體內(nèi)試驗檢驗的氫調(diào)控手段，才具有實際生產(chǎn)中推廣的價值。

4 結(jié) 語

隨著反芻動物甲烷減排研究，飼養(yǎng)試驗、體外模擬瘤胃發(fā)酵、產(chǎn)甲烷菌純培養(yǎng)等研究方法不斷純熟，但產(chǎn)甲烷菌與瘤胃微生物間的互作機制尚待完善，深入研究產(chǎn)甲烷菌與原蟲、細菌、真菌間的種間氫傳遞，有助于發(fā)掘安全可靠、經(jīng)濟可行、高效持久的甲烷減排途徑。降甲烷研究已經(jīng)從單一向多元化、粗放到精確化發(fā)展。多種氫調(diào)控機制的添加劑聯(lián)用及間歇飼喂、幼齡反芻動物瘤胃早期調(diào)控、甲烷生成途徑關(guān)鍵酶調(diào)控將是畜牧業(yè)甲烷減排的發(fā)展方向。瘤胃不僅是甲烷減排工程的重要對象，同時也是研究微生物間互作的良好模型，蘊含著無窮的奧秘。