李藝柔 吳 思 趙 靜

(河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 石家莊 050024)

2018年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給了美國(guó)免疫學(xué)家James P. Allison和日本生物學(xué)家本庶佑(Tasuku Honjo)，以表彰兩位科學(xué)家在癌癥治療的免疫負(fù)調(diào)控領(lǐng)域所做出的卓越貢獻(xiàn)。與傳統(tǒng)的腫瘤療法不同，免疫治療基于新的變革性的理念： 激活或改造人體免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤的固有功能，并使其成為攻擊癌細(xì)胞的有力武器。

20世紀(jì)90年代，James P. Allison發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4， CTLA-4)可以對(duì)免疫系統(tǒng)起到“剎車”作用，他意識(shí)到如果能夠解除免疫系統(tǒng)的“剎車”機(jī)制，就可以提高免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊能力，為癌癥治療開(kāi)創(chuàng)了全新的免疫療法思路[1]，James P. Allison也因此榮獲2015年拉斯克獎(jiǎng)。在Allison發(fā)現(xiàn)CTLA-4可以起到免疫系統(tǒng)抑制劑作用之前，Tasuku Honjo團(tuán)隊(duì)于1992年首次鑒定并克隆了程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed death-1， PD-1)，并最終確認(rèn)PD-1起著免疫系統(tǒng)“制動(dòng)器”作用[2]。2014年，PD-1阻斷藥物納武單抗OPDIVO(Nivolumab)在日本獲批臨床應(yīng)用。除此之外，還有數(shù)位科學(xué)家(如華人學(xué)者、耶魯大學(xué)教授陳列平以及丹納·法伯癌癥研究院的Gordon Freeman等)也在這一領(lǐng)域做出了關(guān)鍵性的突破。具有卓越臨床療效的癌癥的免疫療法的創(chuàng)立為人類治愈癌癥帶來(lái)了希望。

1 癌癥免疫療法的早期研究

1813年，法國(guó)醫(yī)生Arsène-Hippolyte Vautier注意到感染了氣性壞疽的癌癥患者出現(xiàn)腫瘤自行消退的現(xiàn)象,這一發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì)使用細(xì)菌治療腫瘤的關(guān)注；1868年，德國(guó)醫(yī)生W.Busch利用丹毒感染癌癥患者，顯示了一定的腫瘤治療效果，而該項(xiàng)研究結(jié)果在1882年又被德國(guó)內(nèi)科醫(yī)生Friedrich Fehleisen所證實(shí)；19世紀(jì)90年代，被譽(yù)為“免疫療法之父”的美國(guó)醫(yī)生William B. Coley通過(guò)為一個(gè)肉瘤患者注射丹毒而消除了其身上致命的肉瘤，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)立了“Coley毒素”療法。

20世紀(jì)早期，德國(guó)科學(xué)家Paul Ehrlich因發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體的效應(yīng)功能并提出抗體側(cè)鏈形成理論，與俄國(guó)科學(xué)家Ilya Ilyich Mechnikov共同分享了1908年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；1909年，Paul Ehrlich進(jìn)一步討論了自然免疫和獲得性免疫在對(duì)抗癌癥過(guò)程中的不同效應(yīng)。1915年，美國(guó)醫(yī)生Leo Loeb發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)在影響實(shí)驗(yàn)移植腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中扮演了重要角色，并首次提出了激素和腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

20世紀(jì)50年代，美國(guó)科學(xué)家Richmond T. Prehn等采用近交系小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面存在特異性移植抗原；20世紀(jì)70年代，澳大利亞免疫學(xué)家Frank Macfarlin Burnet提出“免疫監(jiān)視”理論，即機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠通過(guò)細(xì)胞免疫機(jī)制識(shí)別并清除癌變的異常細(xì)胞。

1977年美國(guó)科學(xué)家Eva Klein等人提出腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫療法概念；1986年，美國(guó)科學(xué)家Steven A Rosenberg首先提出了腫瘤細(xì)胞免疫療法的基本原理，并進(jìn)行了臨床試驗(yàn)： 將在體外獲得淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)回輸給患者，用于腫瘤的治療[3]，這就是第一代腫瘤細(xì)胞的免疫治療——LAK細(xì)胞療法。

2 CTLA-4的發(fā)現(xiàn)及免疫檢查點(diǎn)抑制劑概念的提出

1980年，美國(guó)科學(xué)家John A. Hansen利用單克隆抗體技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞表面分子CD28；1986年，美國(guó)科學(xué)家Paul J. Martin發(fā)現(xiàn)CD28可以發(fā)揮共刺激作用介導(dǎo)T細(xì)胞激活；四年以后，CD28的天然配基B7被鑒定。無(wú)獨(dú)有偶，1987年，在CTLA-4 被Brunet研究團(tuán)隊(duì)鑒定的同一年，其cDNA隨后便被法國(guó)科學(xué)家Pierre Goldstein實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)克隆[4]。研究人員證實(shí)CTLA-4與CD28都是免疫球蛋白(Ig)超家族成員，有單個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域，但其功能仍然未知。1991年，美國(guó)科學(xué)家Peter Linsley等人采用基因重組方法構(gòu)建了一種可溶性嵌合蛋白——CTLA-4-Ig，并且證明了相較于CD28， CTLA-4具有與B7更強(qiáng)的結(jié)合能力。在之后的幾年中，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為CTLA-4與T細(xì)胞共刺激分子CD28一樣能激活T細(xì)胞活化。1994年，Walunas等人通過(guò)阻斷性抗體研究，發(fā)現(xiàn)CTLA-4其實(shí)是T細(xì)胞活化的負(fù)向調(diào)控因子[5]。在Walunas等人的研究成果發(fā)表后不久，James Allison團(tuán)隊(duì)于1995年也得到了同樣的結(jié)論。

隨著CTLA-4功能的揭示，一些研究人員開(kāi)始嘗試將CTLA-4對(duì)淋巴細(xì)胞的負(fù)調(diào)控作用作為治療自身免疫疾病的新手段。然而，Allison卻開(kāi)辟了一條新的思路，他對(duì)CTLA-4進(jìn)行了深入的研究并發(fā)現(xiàn)，阻斷CTLA-4誘導(dǎo)的免疫負(fù)調(diào)控作用，免疫系統(tǒng)的束縛就會(huì)被解除。1994年，Allison研究團(tuán)隊(duì)將CTLA-4的抗體注射入患有腫瘤的小鼠體內(nèi)，通過(guò)激活小鼠體內(nèi)的抗腫瘤T細(xì)胞成功治愈了患癌小鼠，并在同年的圣誕節(jié)期間對(duì)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證[6]。之后又有其他研究人員證明，阻斷CTLA-4可在體外和體內(nèi)增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答，并發(fā)揮抗腫瘤作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Allison先前提出的通過(guò)阻斷CTLA-4可增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)的假設(shè)。Allison等人還發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)具有“免疫記憶”功能，注射CTLA-4抗體后的小鼠擁有對(duì)腫瘤的記憶，免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)二次接種的腫瘤細(xì)胞再次發(fā)動(dòng)攻擊。

這項(xiàng)工作標(biāo)志著一種新的腫瘤免疫療法的誕生——即利用單克隆抗體解除免疫抑制作用來(lái)對(duì)腫瘤進(jìn)行治療，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors， ICI)的概念也隨之被提出。Allison實(shí)驗(yàn)室還進(jìn)行了許多不同類型腫瘤模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究范圍包括前列腺癌、乳腺癌以及黑色素瘤，并針對(duì)性地采取了不同組合的免疫聯(lián)合療法。短時(shí)間內(nèi)，Allison團(tuán)隊(duì)證明了免疫檢查點(diǎn)療法對(duì)不同類型的癌癥動(dòng)物模型均有療效。

1999年，抗CTLA-4單克隆抗體MDX-010(后改名為伊匹單抗，ipilimumab)被Medarex生物技術(shù)公司成功開(kāi)發(fā)。之后美國(guó)的施貴寶公司收購(gòu)了Medarex生物技術(shù)公司并繼續(xù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床的伊匹單抗。丹納·法伯癌癥研究院醫(yī)生Stephen Hodi和Stephen Hodi與施寶貴公司的科學(xué)家通過(guò)研究新的免疫檢查點(diǎn)療法促進(jìn)了腫瘤臨床治療的新發(fā)展。

3 PD-1/PD-L1通路的作用機(jī)制及其在免疫響應(yīng)中的作用

1992年，Tasuku Honjo團(tuán)隊(duì)在日本京都大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室首次鑒定并克隆了PD-1，Honjo等人起初并沒(méi)有想到PD-1抑制劑會(huì)成為治療腫瘤的藥物。一次偶然的機(jī)會(huì)，他們通過(guò)消減雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了PD-1的mRNA在小鼠瀕臨死亡細(xì)胞中的超表達(dá)現(xiàn)象，并因此認(rèn)為該基因可能參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，并將“程序性細(xì)胞凋亡”(programmed cell death)的英文首字母作為其基因命名——“PD”。Honjo團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)PD基因開(kāi)放閱讀框的基因序列的分析，推測(cè)其可能是Ig超家族中的新基因，預(yù)測(cè)編碼一段跨膜蛋白；1994年，Honjo實(shí)驗(yàn)室的Takashi Shinohara等人報(bào)道了PD-1基因的染色體定位[7]；之后，他們又在1996年利用PD-1單克隆抗體技術(shù)證明了PD-1在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞以及未成熟淋巴細(xì)胞表面均有表達(dá)。

1996年，Honjo團(tuán)隊(duì)用一只具有C57Bl遺傳背景的敲除PD-1基因小鼠進(jìn)行了首次功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除PD-1的小鼠起初具有輕微的脾腫大和B細(xì)胞浸潤(rùn)表型，而在晚年實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)了系統(tǒng)性紅斑狼瘡病癥。在此之后，研究人員用各種遺傳背景的小鼠進(jìn)行了PD-1敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與CTLA-4基因敲除的小鼠類似，在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)不同類型的T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)了自身免疫疾病。因此，Honjo得出結(jié)論： PD-1具有與CTLA-4類似的免疫抑制功能。研究人員通過(guò)分析其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)PD-1具有一段基于免疫受體酪氨酸的轉(zhuǎn)換基序(ITSM)，并且認(rèn)為PD-1與CD28/CTLA-4為同一類蛋白受體家族成員[8]。

1999年，華人學(xué)者、耶魯大學(xué)教授陳列平團(tuán)隊(duì)首次鑒定了B7-H1分子，但是當(dāng)時(shí)并未證明它會(huì)與PD-1發(fā)生結(jié)合[9]。2000年，Gordon Freeman在陳列平教授發(fā)現(xiàn)B7-H1之后，證明了B7-H1/PD-1的相互作用，并將這一分子改名為PD-1的第一個(gè)配基(PD-L1)。在此之后，PD-1的第二個(gè)配基(PD-L2)CD273也很快被Gordon Freeman、 Tasuku Honjo和Arlene Sharpe的合作團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)；2002年，陳列平教授和Honjo等人發(fā)現(xiàn)B7-H1充當(dāng)了腫瘤細(xì)胞的“盾牌”，使后者免遭T細(xì)胞的攻擊，并首次將B7-H1應(yīng)用于腫瘤免疫方向。

2004年，陳列平團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)B7-H1(PD-L1)敲除小鼠并沒(méi)有明顯的自身免疫表型，只是在肝臟部位有一定的免疫活化，這一工作進(jìn)一步驗(yàn)證了B7-H1的免疫負(fù)調(diào)控作用，并且檢驗(yàn)了這一途徑作為藥物靶點(diǎn)的安全性[10]；2005年，陳列平團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，相比于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞表面會(huì)更高水平地表達(dá)PD-1的配基蛋白；同年，研究人員首次報(bào)道了將PD-1受體的抗體應(yīng)用于小鼠腫瘤模型臨床治療。Honjo等人的偉大發(fā)現(xiàn)為我們今天將PD-1/PD-L1信號(hào)通路應(yīng)用于臨床治療提供了大量的理論依據(jù)： 首先Honjo等人發(fā)現(xiàn)抗PD-1療法可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，并且這種反應(yīng)不依賴于腫瘤細(xì)胞表面PD-L1/PD-L2的表達(dá)；其次，抗PD-1療法可以發(fā)揮與抗CTLA-4療法相同甚至更好的療效，但PD-1免疫療法的副作用比CTLA-4免疫療法更小。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞可以高表達(dá)PD-L1實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，而通過(guò)抗體在體外或體內(nèi)阻斷該途徑均可以恢復(fù)T細(xì)胞特異性攻擊腫瘤細(xì)胞的免疫功能，PD-1/PD-L1整個(gè)通路機(jī)理的逐漸清晰，為腫瘤免疫治療帶來(lái)了新的機(jī)遇。

4 免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法的現(xiàn)在與未來(lái)

2014年，威爾·康奈爾醫(yī)學(xué)院的Alexandra Snyder等人利用大規(guī)模并行測(cè)序，確定了在黑色素瘤患者中可從CTLA-4阻斷治療中獲益的遺傳基礎(chǔ)；2015年，紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的Timothy A. Chan等人又在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)的新抗原會(huì)影響腫瘤對(duì)PD-1抗體治療的響應(yīng)情況;同年，美國(guó)丹納·法伯癌癥研究院等處的研究人員發(fā)現(xiàn)一些能通過(guò)新型癌癥免疫療法得到治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者所產(chǎn)生的腫瘤抗原并不相同，這說(shuō)明免疫療法靶向的分子靶標(biāo)可能因人而異。

2017年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了兩種嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療(CAR-T)，每個(gè)人個(gè)性化的免疫細(xì)胞被重新設(shè)計(jì)來(lái)攻擊癌癥。2018年的研究結(jié)果表明，腫瘤環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)可以使癌細(xì)胞躲避免疫系統(tǒng)的識(shí)別，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)為患有不同癌種的轉(zhuǎn)移性癌癥患者，以及具有較差預(yù)后但尚未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者開(kāi)發(fā)首個(gè)免疫治療藥物開(kāi)辟了新的道路。

綜上所述，利用抗體藥物發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用的機(jī)制是十分復(fù)雜的，CTLA-4和PD-1/PD-L1分子通路由于具有不同的受體動(dòng)力學(xué)表達(dá)模式，使它們?cè)诿庖叻磻?yīng)中發(fā)揮著互補(bǔ)作用；新的臨床研究結(jié)果也表明，靶向作用CTLA-4和PD-1的聯(lián)合療法對(duì)黑色素瘤病人會(huì)有更加顯著的療效。目前，針對(duì)多種不同類型癌癥的免疫檢查點(diǎn)療法應(yīng)運(yùn)而生，一些新的檢查點(diǎn)蛋白也被嘗試用于癌癥的靶向治療。相信在不久的將來(lái)，該療法將從各個(gè)水平得到優(yōu)化，從而發(fā)揮更好的療效。這也再一次說(shuō)明了James Allison和Tasuku Honjo工作的開(kāi)創(chuàng)性貢獻(xiàn)，他們的發(fā)現(xiàn)為腫瘤療法提供了新的思路和手段，是人類抗擊癌癥的里程碑式的標(biāo)志。