許金蔓,高 尚,張信軍,成大榮,王彥紅,鞠輝明

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

豬鏈球菌病為急性敗血性鏈球菌病,是由豬鏈球菌引起的感染性強(qiáng)、病死率高的一種熱性傳染病。豬鏈球菌是一種需氧或兼性厭氧革蘭陽性菌,也是一種人獸共患病病原[1]。豬鏈球菌有著極高的致病性,除了易感動(dòng)物豬外,牛、羊和人等哺乳類動(dòng)物以及犬、貓、馬等動(dòng)物也能感染此菌[2-3]。其中羊感染此菌可通過消化道、皮膚損傷、臍帶以及與帶菌野豬接觸等渠道感染,病菌可存在于泥土、灰塵、潮濕環(huán)境或者侵?jǐn)_的草叢當(dāng)中,由此增加羊感染此菌的機(jī)率。

豬鏈球菌病是世界各地規(guī)?；B(yǎng)豬場的常見疾病,大多數(shù)國家都有相關(guān)報(bào)道[4]。然而,有關(guān)羊感染此菌的,或感染后呈流行性趨勢的案例,國內(nèi)外僅有少數(shù)報(bào)道[5]。此次從兩頭死亡的山羊中分離到豬鏈球菌,并對其分子生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行研究。

1 發(fā)病情況與臨床癥狀

2018年5月30日,揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院接到一例山羊陸續(xù)死亡的病例。主訴：共養(yǎng)了100只羊,發(fā)病的山羊數(shù)為10只以上,陸續(xù)死亡的有7到8只,死亡時(shí)山羊眼結(jié)膜充血,有透明的黏液性鼻液流出。剖檢可見肺氣腫、淤血,真胃有很多小點(diǎn)潰瘍,腸系膜淋巴結(jié)腫大。

2 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

2.1 細(xì)菌分離 取病死羊的肺臟、肝臟,無菌接種于血瓊脂平板。一組置于有氧條件下,另一組放入?yún)捬豕拗胁⒓尤雲(yún)捬醴磻?yīng)袋,于37℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。24 h后于無菌條件下挑取血瓊脂平板上不同形態(tài)的菌落接種于新的血液瓊脂平板上,于37℃條件下培養(yǎng)24 h,再挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色,鏡檢。

2.2 生化試驗(yàn) 采用鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管對分離得到的菌株進(jìn)行生化指標(biāo)的鑒定。在37℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。

2.3 16S rDNA鑒定 按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法操作,通過煮沸法進(jìn)行DNA模板的制備,引物通過生物公司合成,緊接著做PCR鑒定,將PCR的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳試驗(yàn)。

2.4 小鼠攻毒試驗(yàn) 購自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心的6周齡小鼠4只,雌雄各半,分為兩組。一組采用攻毒處理,一組作為對照組。試驗(yàn)組小鼠采用腹腔注射處理,劑量均為0.1 mL菌液,菌液濃度為1.5×108CFU/mL,對照組小鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水。給予相同的鼠糧和水源,飼養(yǎng)觀察。對死亡小鼠的肺、脾、肝、腎制作病理切片,觀察其病理變化。

2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),將分離菌培養(yǎng)物均勻涂布于血平板上,無菌取藥敏片貼于平板上,37℃培養(yǎng)24 h后,測定抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果判定按照杭州天和微生物試劑有限公司發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離 取病死羊肺臟、肝臟組織在無菌條件下接種于血瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)24 h后,血瓊脂平板中長出散在的淡灰色、透明隆起,邊緣整齊的露珠樣小菌落,菌落周圍呈現(xiàn)溶血現(xiàn)象。經(jīng)過純化培養(yǎng)后,鏡檢可見菌株是革蘭陽性菌,呈單個(gè)或雙鏈狀排列,有些呈短鏈狀排列(見中插彩版圖1)。

3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 本菌生化鑒定結(jié)果表明,本菌可以發(fā)酵鼠李糖、葡萄糖、果糖,分解精氨酸、七葉苷,不能分解山梨醇,符合豬鏈球菌的生化培養(yǎng)特點(diǎn)。

3.3 16S rDNA鑒定結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電脈,得到大小為500 bp左右的目的條帶,隨之將擴(kuò)增產(chǎn)物寄往生物公司進(jìn)行測序,所得的序列與數(shù)據(jù)庫中豬鏈球菌AF009501.1為100%符合,測得的細(xì)菌為豬鏈球菌。

3.4 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果 飼養(yǎng)24 h后,試驗(yàn)組全部死亡,對照組小鼠精神正常。對死亡的小鼠進(jìn)行病理解剖發(fā)現(xiàn)肺臟、肝臟、脾臟出血,胸腔出血嚴(yán)重。采取肺臟,無菌接種在綿羊血瓊脂上,于37℃培養(yǎng)24 h,觀察可見平皿上長出淡灰色、濕潤透明、針尖大小的小菌落,與分離菌菌落形態(tài)一致。采取肺臟切面,制作肺觸片,進(jìn)行革蘭染色,于顯微鏡下觀察可見大量藍(lán)紫色,短鏈狀球菌,與分離菌鏡檢形態(tài)一致。病理變化主要是死亡小鼠肝臟中肝索紊亂,肝細(xì)胞腫脹、溶解(見中插彩版圖2),腎臟腎小球結(jié)構(gòu)不全,被破壞(見中插彩版圖3)。

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,本菌對美洛西林、頭孢哌酮極度敏感;對氟苯尼考、左氧氟沙星、丁胺卡那霉素等中度敏感;對卡那霉素、多黏菌素B等耐藥。

4 診斷與小結(jié)

從送檢病死羊的病料中分離出一株細(xì)菌,其菌落形態(tài)、需氧或兼性厭氧特性、生化特性與豬鏈球菌相似,結(jié)合PCR鑒定分析可知分離菌為豬鏈球菌。綜上所述,送檢病死羊感染豬鏈球菌。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離菌對鏈霉素等耐藥,對頭孢哌酮,美洛西林等很敏感,這與文獻(xiàn)[6]記載結(jié)果一致。在臨床疾病防治過程中,要想取得較好的治療效果應(yīng)擴(kuò)大常規(guī)抗菌藥種類進(jìn)行藥敏試驗(yàn),根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,選擇敏感藥物,且注意交替用藥,這樣才能達(dá)到更好的治療效果[7]。

從病死羊分離出豬鏈球菌,這對羊感染豬鏈球菌疾病的診斷和治療具有重要的意義。在平常的飼養(yǎng)當(dāng)中,養(yǎng)殖戶需做好畜禽的衛(wèi)生防疫工作,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,做到早預(yù)防,早診斷,早治療[8-9],盡可能地將養(yǎng)殖場經(jīng)濟(jì)損失降到最低,以及重點(diǎn)關(guān)注場內(nèi)人員直接接觸畜禽的皮膚保護(hù),避免吃生肉或未熟肉,提高自我保護(hù)意識[9]。