邱 月， 汪光明， 徐 俊

(同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

Ligase Ⅳ是參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的DNA連接酶家族之一[1]，與XRCC4(X-ray repair cross comple-menting group 4)形成復(fù)合物連接到DNA雙鏈斷裂處行使其功能[2]，其參與的非同源性末端接合(non-homologous end joining, NHEJ)修復(fù)方式還需要K70/K80蛋白和DNA-PKcs等酶共同完成[3-4]。而Ligase Ⅳ基因完全缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎死亡[5]，Ligase Ⅳ突變的小鼠在胚胎時期會增加神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)的內(nèi)源性損傷，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不健全[6]。本研究利用Ligase Ⅳ突變小鼠為實驗動物，確定其生命周期，并通過體內(nèi)和體外實驗證明Ligase Ⅳ基因?qū)Τ审w神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠與試劑

Ligase ⅣY288C(C57/BL6)雜合子小鼠由四川大學(xué)劉聰教授實驗室友情饋贈，該突變是由乙基亞硝脲(ENU)誘導(dǎo)Ligase Ⅳ基因的第1067位點的堿基A突變成G，從而原本編碼酪氨酸(Y)的密碼子變成了編碼半胱氨酸(C)的密碼子,即獲得Ligase ⅣY288C小鼠。用Ligase Ⅳ雜合子交配得到的同窩野生型(WT)小鼠和突變型Ligase ⅣY288C純合子(MU)小鼠作為研究對象，所有小鼠飼養(yǎng)于同濟大學(xué)無特定病原體級實驗動物中心，所有動物實驗操作規(guī)范依據(jù)同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物委員會文件(TJmed-010-10)執(zhí)行。

細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/F12、GlutaMAX、0.05% Trypsin-EDTA、B27購自美國Gibco公司；基底膠Metrigel購自美國BD公司；細(xì)胞因子EGF、bFGF購自美國R&D公司；一抗抗體Ki67(兔源)、Sox2(羊源)、Nestin(鼠源)購自美國Thermo公司；二抗Donkey-Rabbit/Goat/Mouse-cy3/488購自美國Jackson公司；DAPI染色液購自中國國藥試劑公司。

1.2 小鼠體質(zhì)量統(tǒng)計

對不同發(fā)育時間點的WT(n=7)和MU(n=7)雌雄小鼠體質(zhì)量進行稱量，統(tǒng)計從1周到4月齡的雄性WT小鼠(M-WT)，雌性WT小鼠(F-WT)，雄性MU小鼠(M-MU)，雌性MU小鼠(F-MU)的體質(zhì)量。

1.3 小鼠標(biāo)本收集

稱重4.5月齡WT和MU小鼠，記錄小鼠的體質(zhì)量和生命周期，配制0.5%戊巴比妥鈉麻醉劑，按100mL/5g體質(zhì)量的劑量注射小鼠進行麻醉，用4%多聚甲醛灌注小鼠以固定組織，取出WT和MU小鼠腦稱重。小鼠腦組織經(jīng)10%、20%、30%蔗糖溶液中脫水并保存在30%蔗糖溶液中以便后續(xù)使用。

1.4 小鼠腦組織冰凍切片免疫熒光染色

用OCT包埋小鼠大腦，并進行冠狀冰凍切片，片厚20μm，收集側(cè)腦室下區(qū)(SVZ)腦片，將切好的腦片按順序貼在載玻片上，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，3%BSA封閉40min。一抗孵育過夜，PBS清洗3遍。二抗室溫孵育2h，DAPI室溫孵育30min，PBS清洗3遍。在倒置熒光顯微鏡下檢測熒光信號，用共聚焦顯微鏡拍照統(tǒng)計NSCs數(shù)量等。對4.5月齡的WT和MU小鼠鼠腦進行冰凍切片，并進行Sox2免疫熒光染，通過對WT(n=6)和MU(n=6)小鼠相同區(qū)域內(nèi)Sox2活性細(xì)胞統(tǒng)計為了進一步了解Ligase Ⅳ基因?qū)π∈笊窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。用NSCs增殖標(biāo)志物Ki67對小鼠冰凍切片做免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)WT小鼠SVZ的NSCs增殖比MU小鼠多。通過對WT(n=3)和MU(n=3)小鼠相同區(qū)域內(nèi)Ki67活性細(xì)胞統(tǒng)計。

1.5 體外NSCs增殖實驗

小鼠體內(nèi)實驗顯示： MU小鼠SVZ的NSCs增殖減少。為了進一步驗證上述結(jié)果，分離WT(n=3)和MU(n=3)小鼠的原代NSCs進行培養(yǎng)。消化NSCs成單細(xì)胞懸液并計數(shù)，按照1×103/mL的密度接種到6孔板里，每孔接種2mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)5d，分別對第1代(P1)細(xì)胞和第4代(P4)細(xì)胞進行統(tǒng)計分析，40倍顯微鏡下統(tǒng)計直徑>30μm的神經(jīng)球的數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 WT和MU小鼠生存曲線

對同窩的WT(n=23)和MU(n=23)小鼠的死亡時間進行記錄，統(tǒng)計從小鼠出生到7月齡不同基因型小鼠的生命周期，用GraphPad Prism 6.0分析小鼠的生存曲線(圖1)，結(jié)果顯示： WT小鼠在觀察期內(nèi)無死亡，MU小鼠的生存率逐步降低，1月齡時出現(xiàn)死亡，4.5月齡的生存率低于50%，7月齡生存率僅為9%(P<0.0001)。

圖1 WT和MU小鼠生存曲線Fig.1 Survival curves of WT and MU mice

2.2 WT和MU小鼠體質(zhì)量差異

對比4.5月齡不同基因型雄性小鼠的體態(tài)大小，成年WT小鼠體質(zhì)量明顯大于MU小鼠(圖2)。WT小鼠的體質(zhì)量比同等發(fā)育時長的MU小鼠體質(zhì)量大且差異越來越明顯，M-WT小鼠體質(zhì)量比F-WT小鼠體質(zhì)量大，MU雌雄小鼠體質(zhì)量差異(表1)。

圖2 WT和MU小鼠形態(tài)對比Fig.2 Morphological contrast of WT and MU mice左側(cè)： WT小鼠，右側(cè)： MU小鼠

2.3 WT和MU小鼠腦質(zhì)量差異

WT小鼠腦組織明顯大于MU小鼠腦質(zhì)量(圖3)。統(tǒng)計結(jié)果顯示： WT小鼠的腦質(zhì)量平均為(0.34±0.035) g，MU小鼠的腦質(zhì)量平均為(0.24±0.021) g，兩組小鼠腦質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。

表1 不同時間各組小鼠體質(zhì)量

圖3 WT和MU小鼠腦質(zhì)量對比Fig.3 Comparison of brain weight in WT and MU Mice左側(cè)： WT小鼠，右側(cè)： MU小鼠

2.4 不同基因型小鼠SVZ的NSCs數(shù)量分析

小鼠大腦冰凍切片SVZ的Sox2和Nestin免疫熒光染色結(jié)果見圖4，綠色熒光為Sox2陽性細(xì)胞，紅色熒光為Nestin陽性細(xì)胞。統(tǒng)計結(jié)果顯示： WT小鼠SVZ的NSCs平均值是(101±5.8)個，MU小鼠SVZ的NSCs平均值是(79±4.1)個，MU小鼠SVZ的NSCs數(shù)量是WT小鼠的78%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 4.5月齡的WT和MU小鼠SVZSox2免疫染色Fig.4 Immunostaining of Sox2 in SVZ of 4.5-month WT and MU mice標(biāo)尺： 50μm

2.5 不同基因型小鼠SVZ的NSCs體內(nèi)增殖分析

免疫熒光染色見圖5，綠色熒光為Nestin陽性細(xì)胞，紅色熒光為Ki67陽性細(xì)胞。統(tǒng)計結(jié)果顯示： WT小鼠SVZ的NSCs增殖的平均值為(145±6.7)個，MU小鼠SVZ的NSCs增殖的平均值為(92±5.5)個，MU小鼠SVZ的NSCs的數(shù)量是WT小鼠的63%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 4.5月齡的WT和MU小鼠SVZ Ki67免疫染色Fig.5 Immunostaining of Ki67 in SVZ of 4.5-month WT and MU Mice標(biāo)尺： 50μm

2.6 不同基因型小鼠的NSCs體外增殖能力分析

第1代NSCs(P1)單細(xì)胞及培養(yǎng)5d后NSCs在100倍顯微鏡下觀察結(jié)果見圖6A，第4代NSCs(P1)分別在40和100倍顯微鏡下觀察結(jié)果見圖6B。WT小鼠細(xì)胞克隆大于MU小鼠細(xì)胞克隆，尤其以P1細(xì)胞最為明顯。1000個單細(xì)胞統(tǒng)計結(jié)果顯示： WT小鼠P1細(xì)胞最終形成克隆平均數(shù)是(38.5±3.6)個，MU小鼠是(22.5±2.3)個，MU小鼠細(xì)胞形成克隆數(shù)是WT小鼠的58%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)；WT小鼠P4細(xì)胞最終形成克隆平均數(shù)是(18.5±1.9)個，MU小鼠是(3.5±0.51)個，MU小鼠細(xì)胞形成克隆數(shù)是WT小鼠的19%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

3 討 論

NSCs不僅存在于胚胎發(fā)育期間，而且存在于包括人類在內(nèi)的所有成體哺乳動物腦中。成體NSCs主要位于側(cè)腦室的SVZ和海馬齒狀回的SGZ。NSCs的主要功能是維持組織穩(wěn)態(tài)，通過產(chǎn)生大量的新生神經(jīng)元整合神經(jīng)回路中。成體神經(jīng)發(fā)生對環(huán)境、生理刺激和神經(jīng)元活性高度敏感。神經(jīng)發(fā)生的減少可能是由NSCs的丟失或某些后續(xù)步驟的功能障礙引起的，因此區(qū)分這些可能性對于理解神經(jīng)退行性疾病的原因很重要[7-9]。

圖6 不同基因型小鼠P1和P4 NSCs克隆Fig.6 P1 and P4 neural stem cell cloning in different genotype mouse標(biāo)尺： 50μm

不同強度的電離輻射會對NSCs造成不同程度的衰老和損傷[10]，干細(xì)胞對衰老和損傷有不同的反應(yīng)機制，NSCs對損傷的適當(dāng)反應(yīng)是維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的[11-12]。DNA雙鏈斷裂(DSB)是一種重要的細(xì)胞損傷形式，NSCs可通過凋亡、細(xì)胞周期停滯或DNA修復(fù)應(yīng)答DSB。DSB的修復(fù)對于維持NSCs基因組穩(wěn)定性及其功能至關(guān)重要，主要的修復(fù)方式包括NHEJ和同源重組(homologous recombination, HR)[13-14]。胚胎時期的NSCs大部分處于激活狀態(tài)，成體NSCs主要處于靜息狀態(tài)，因此HR和NHEJ分別對于胚胎和成體NSCS的DSB修復(fù)起到重要作用。

NHEJ是修復(fù)多細(xì)胞真核生物雙鏈斷裂的主要途徑，其過程首先是Ku70//Ku80異二聚體黏附于斷裂的DNA末端，DNA-PKcs和其他酶連接在Ku70//Ku80異二聚體上，然后Ligase Ⅳ和XRCC4形成的復(fù)合物被招募到DNA斷裂處，催化最終的末端連接反應(yīng)[15-16]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷的積累會增加神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及癌癥的發(fā)生概率，Ligase Ⅳ突變的小鼠更是會增加髓母細(xì)胞瘤的形成[17-20]，并且其在胚胎時期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不健全[21]，說明Ligase Ⅳ對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。本研究在成體水平探討Ligase Ⅳ突變對成體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。本研究首先發(fā)現(xiàn)MU小鼠生命周期短，在個體形態(tài)學(xué)上MU小鼠體質(zhì)量在生長發(fā)育的各個時期都明顯小于WT小鼠，同之前文獻[22]報道一致，說明Ligase Ⅳ突變嚴(yán)重影響了小鼠個體發(fā)育。此外，本研究發(fā)現(xiàn)相對于WT小鼠，MU小鼠雌雄個體間體質(zhì)量上沒有明顯差異，其可能的原因是MU小鼠發(fā)育缺陷，體質(zhì)量普遍小，因此在生長過程中雌雄差異不明顯。進一步研究Ligase Ⅳ突變對成體神經(jīng)系統(tǒng)的影響，本研究發(fā)現(xiàn)MU小鼠的腦質(zhì)量明顯小于WT小鼠，表明Ligase Ⅳ缺陷同時影響個體和組織器官的發(fā)育。體內(nèi)研究表明，MU小鼠大腦SVZ的NSCs數(shù)量及增殖細(xì)胞數(shù)量都少于WT小鼠；體外研究表明，MU小鼠NSCs的克隆形成能力低于WT小鼠，體內(nèi)體外實驗結(jié)果一致。所以MU小鼠腦質(zhì)量小可能是由NSCs減少和增殖減少引起的。

NHEJ修復(fù)途徑中Ligase Ⅳ的突變會影響細(xì)胞DNA損傷修復(fù)。造成的DNA損傷積累使NSCs細(xì)胞周期停滯、增殖能力下降、凋亡增加，從而導(dǎo)致成體神經(jīng)再生能力降低，進而影響個體神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，這說明Ligase Ⅳ突變對小鼠生長及成體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育起重要作用。由此推測Ligase Ⅳ突變造成干細(xì)胞的缺陷在其他組織器官中也會產(chǎn)生重要影響。本研究為成體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供了新的理論基礎(chǔ)，成體神經(jīng)發(fā)生的研究對于進一步了解大腦功能、神經(jīng)性疾病的發(fā)病機制以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)等都具有重要的意義。