苗麗娟，尹柏雙，張立春，劉東旭

2017年3月吉林市磐石某規(guī)?；i場28日齡仔豬，發(fā)病44頭，死亡5頭，病豬表現(xiàn)為皮膚表面有出血斑點、消瘦、體溫升高，剖檢腹股溝淋巴結(jié)、扁桃體腫大出血、纖維素滲出明顯、腸里面有氣體，然后進行實驗室診斷，確診為豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2 )感染。

PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)等相關(guān)疾病的主要病原，該病1991年在加拿大首次報道[1-2],由于PCV2具有致病性， 5～12周齡仔豬一旦感染，死亡率可高達40%-50% ;由于在淋巴細胞中PCV2亦可增殖，導(dǎo)致免疫細胞凋亡，因此造成豬免疫抑制，從而繼發(fā)PPV、PRRS及CSFV等相關(guān)疾病的感染[2-3]，經(jīng)常給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，引起各國重視。

1 材料和方法

DNA提取試劑盒(康為世紀有限公司生產(chǎn))、TaqDNA聚合酶(含10 x Buffer 25mmo1/LMCl2) , dNTP、(寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn));PK 15細胞(無PCV, HCV, PRV, PPV,PRRS,支原體等6種病原)。

1.1 樣品研磨及處理

自吉林磐石某豬場剖檢病死豬，分別采集疑似感染PCV2豬的肝臟、肺臟、腹股溝淋巴結(jié)、扁桃體。研磨采集到的組織病料，取上清，按照試劑盒說明書提取DNA，將提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 可疑組織的PCR擴增及鑒定

應(yīng)用PCV2檢測引物，P1：ACA GGA TCC ATG GCA TCT TCA ACA C；P2：GAA AG CTTT TCA TTA AGG GTT AAG T；產(chǎn)物長度581 bp。PCR的反應(yīng)體系為25 μL，DNA 3 μL、1 μL的P1/P2(20 pmol/μL)、3 μL dNTP(2.5 mmol/μL)，2.5 μL 的10×buffer、0.25 μL的 rTaq 酶、14.25 μL的滅菌水，反應(yīng)條件為25個cycle，預(yù)變性 94 ℃ 5 min后，進入循環(huán) 94 ℃ 45S, 55 ℃ 45S, 72 ℃ 45S，72 ℃延伸 7 min。1.2 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，結(jié)果見圖1。

1.3 病毒的分離、鑒定

經(jīng)檢測后為陽性的病理組織的上清以0.22 μm的濾器濾過，接種PK-15細胞，按照1%比例接種，盲傳7代，常規(guī)方法提取DNA，最后加滅菌去離子水15 μL溶解，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增并測序

應(yīng)用Oligo6.24軟件設(shè)計的PCV2全長引物，P1：5-CTGGCCCTGCTCCCCGATCAT-3，P2：5-GGGCCAGAATTCAACCTTAAC-3。PCR的反應(yīng)體系為25 μL，1 μL的P3/P4(20 pmol/μL)、3 μL dNTP(2.5 mmol/μL)，2.5 μL 的10×buffer、0.25 μL的 rTaq 酶、14.25 μL的滅菌水，反應(yīng)條件為35個cycle，預(yù)變性 94 ℃ 5 min后，進入循環(huán) 94 ℃ 50S, 54 ℃ 1 min, 72 ℃ 50S，72 ℃延伸 7 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，結(jié)果見圖2，將目的基因與PMD-18T載體連接后送大連寶生物工程公司測序。

圖1 病料檢測結(jié)果M:Marker DL-2000；1:陽性對照;2:扁桃體;3:腹股溝淋巴結(jié)；4:肝臟；5:肺臟;6:陰性對照

圖2 全基因PCR擴增1:全基因;M：DL2000 Marker;2：陰性對照

1.5 PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

運用DNAStar 軟件中Carnier-Robson方法、Chou-Fasman方法預(yù)測吉林新分離株P(guān)CV-2 Cap蛋白的二級結(jié)構(gòu)。Carnier-Robson方法是采用計算特定結(jié)構(gòu)的內(nèi)部含有特定的氨基酸殘基傾向性來預(yù)測PCV2 Cap蛋白的二級結(jié)構(gòu)，采用Chou-Fasman方法預(yù)測PCV2 Cap蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是通過計算氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)而來[3]。

1.6 B細胞抗原表位預(yù)測

對結(jié)構(gòu)蛋白疏水性進行分析，主要采用Kyte-Doolittle方法。Kyte-Doolittle方法是根據(jù)序列的氨基酸組成，預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和親水區(qū)[3]；結(jié)構(gòu)蛋白抗原指數(shù)[4]通過Jameson-Wolf方法進行預(yù)測；結(jié)構(gòu)蛋白表面可能性運用Emini方法進行預(yù)測，而后綜合評價PCV-2 Cap結(jié)構(gòu)蛋白B細胞抗原表位的地位。

2 結(jié)果

2.1 病理組織PCR檢測結(jié)果

經(jīng)PCR檢測，在扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)、肝臟組織中擴增出581目的帶，說明此頭豬感染PCV2，結(jié)果見圖1。

2.2 PCR 檢測傳代病毒及全基因克隆

將盲傳到第7代的病毒進行PCR擴增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 1780bp見到目的帶，說明此病毒分離成功，結(jié)果見圖2。

2.3 PCV-2 Cap蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用Carnier-Robson方法預(yù)測PCV2 Cap蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它并沒有形成α螺旋結(jié)構(gòu)，但是形成許多β折疊結(jié)構(gòu)，各個帶有長短不同轉(zhuǎn)角的折疊單元，會影響蛋白的柔韌性。該預(yù)測結(jié)果表明：一些小的α螺旋結(jié)構(gòu)存在于Cap蛋白的跨膜區(qū)中(見圖3)。

運用Chou-Fasman方法預(yù)測PCV2 Cap蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：在第68-74aa、97-105aa、129-137aa、183-188aa、219-225aa區(qū)段存在有少量的α螺旋結(jié)構(gòu)。但用該方法預(yù)測的β折疊結(jié)構(gòu)主要位于第19-25aa、44-65aa、148-152aa、194-201aa、210-223aa，轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)較少(見圖3)。

圖3 Carnier-Robson和Chou-Fasman方法預(yù)測PCV2 Cap蛋白的二級結(jié)構(gòu)A:α-螺旋結(jié)構(gòu)；B:β-折疊；C:轉(zhuǎn)角區(qū)域；T:無規(guī)則卷曲

2.4 PCV-2 Cap蛋白親水性預(yù)測分析

如圖4所示，運用Kyte-Doolittle(1982)方法對PCV-2吉林新分離株的Cap蛋白進行預(yù)測，主要是通過蛋白質(zhì)的氨基酸序列來進行親水性分析，正值為親水的，負值為疏水的。結(jié)果顯示該蛋白存在眾多親水性的區(qū)域，并且位于第1-45aa、84-103aa、173-193aa親水性指數(shù)較高， 位于第140-164aa、204-214aa、222-234aa也有親水性,表明此區(qū)域暴露在表面的概率很大，因此，成為抗原表位的概率極大。

圖4 PCV-2 Cap蛋白親水性預(yù)測分析

2.5 PCV-2 Cap蛋白的表面可能性預(yù)測分析

發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在PCV-2 Cap蛋白表面可能性很大的氨基酸區(qū)域，主要是位于第4-16aa、第32-43aa、第48-67aa、第95-103aa、第138-163aa、第173-181aa區(qū)段，如圖5所示，其它部位顯示為負值或展示的可能性較小。

圖5 PCV-2 Cap蛋白出現(xiàn)在表面可能性預(yù)測分析

2.6 PCV-2 Cap蛋白骨架區(qū)的柔韌性預(yù)測分析

PCV-2 Cap蛋白骨架區(qū)具有比較多的，且分布比較均勻的柔韌性區(qū)域，提示PCV-2 Cap蛋白發(fā)生折疊和扭曲的概率較高，肽段的柔韌性較高，可以形成豐富的二級結(jié)構(gòu)(如圖 6)。

圖6 PCV-2 Cap蛋白骨架區(qū)的柔韌性預(yù)測分析

2.7 PCV-2 Cap 蛋白B細胞抗原表位的預(yù)測分析

通過綜合以上親水性分析、計算表面概率、骨架的柔韌性分析、預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法進行分析，結(jié)果顯示:PCV-2 Cap蛋白含有許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域，既PCV-2 Cap 蛋白潛在的蛋白抗原決定簇，如第3-20aa、第57-67 aa、第82-91 aa、第108-121 aa、第154-171 aa、第225-234 aa區(qū)段，表明該區(qū)段具有潛在的優(yōu)勢抗原表位，如圖7。盡管有些肽段的抗原指數(shù)比較高，但由于其親水性或呈現(xiàn)表面概率較低，因此要綜合這些預(yù)測參數(shù)判斷其作為潛在抗原表位的可能性。

圖7 PCV-2 Cap 蛋白的抗原指數(shù)分析

3 討 論

3.1本研究主要是對PCV2吉林磐石新分離株的全基因進行克隆和測序，測序結(jié)果表明其在ORF2基因上變異較大，同時根據(jù)Cap 結(jié)構(gòu)蛋白的特點使其成為在分子水平上檢測PCV2特異性的理想抗原。

3.2采用計算機和生物學(xué)軟件分析技術(shù)，預(yù)測和分析了PCV2 Cap蛋白的二級結(jié)構(gòu)、潛在的B淋巴細胞的優(yōu)勢抗原表位。結(jié)果表明：在第3-20aa、第57- 67 aa、第82-91 aa、第108-121 aa、第154-171 aa、第225-234 aa區(qū)段具有潛在的優(yōu)勢抗原表位，Cap蛋白α螺旋的形成能力比較差，但是形成許多β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)單元，可能與該蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)組成有關(guān)，所以該分離株Cap蛋白二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜。