俞 萍 鄭昌岳 李 鳳 蔣劍文

（福建省級機(jī)關(guān)醫(yī)院康復(fù)科，福建 福州 350001）

兒童自閉癥 (children autism，CA)又可稱為孤獨(dú)癥，是指在3歲之前發(fā)病，其主要表現(xiàn)癥狀為不同程度的社會交流能力缺陷、語言發(fā)育障礙、重復(fù)刻板以及狹隘的興趣等的一種疾?。?］。由于自閉癥的發(fā)病機(jī)制尚不確切，目前尚無專門針對自閉癥的特異性治療藥物，基礎(chǔ)研究中我們發(fā)現(xiàn)針刺長強(qiáng)穴可改善自閉癥模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力［2］。已有的研究認(rèn)為與自閉癥關(guān)系最密切的腦區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)有前額葉皮層和海馬等［3］。而 Wnt信號通路通過調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育，在早期胚胎發(fā)育中起了重要作用。因此認(rèn)為此通路與自閉癥患者和動(dòng)物模型早期腦的過度發(fā)育有關(guān)［4］。β-catenin是一種多功能信號蛋白，可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與基因的表達(dá)，在Wnt信號通路中處于重要地位。位于通路上游的 GSK-3β是一個(gè)最主要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子， 有效磷酸化 β-catenin，導(dǎo)致 β-catenin的積聚與活化。這兩個(gè)重要蛋白直接影響著Wnt信號通路所起到的生物學(xué)功能。鑒于 β-catenin和 GSK-3β在Wnt信號通路中的關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)擬通過針刺干預(yù)自閉癥模型大鼠長強(qiáng)穴后，觀察這兩個(gè)信號蛋白在大鼠腦海馬內(nèi)的蛋白表達(dá)情況與細(xì)胞形態(tài)的變化，以希望認(rèn)識到這些變化與學(xué)習(xí)記憶功能改善之間的相關(guān)性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑及設(shè)備 丙戊酸鈉（Sigma）；一抗β-catenin（博士德 BA0426）；一抗 GSK-3β（博士德 BA0906）；二抗sp-9001（invitrogen sp-9001）；DAB（北京中杉zli-9032）；Morris水迷宮 RB-100AV2.5.1、生物組織脫水機(jī)ZT-14S；生物組織石蠟包埋機(jī)YB-6LF；RM2015切片機(jī)（德國萊卡）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及動(dòng)物分組 本課題選取福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康成年Wistar雄性300～350 g及雌性 200～250 g大鼠各 10只，待大鼠熟悉環(huán)境1周后，予雌、雄各一只合籠，飼養(yǎng)在帶有托盤的鐵籠子中并過夜，到第二天早晨9點(diǎn)左右，檢查到托盤中有陰栓的雌鼠記為胚胎第 1天 (Embryofoday，E1)，這時(shí)將雌、雄分籠，并將受孕母鼠放入帶有木屑的墊料籠中單獨(dú)飼養(yǎng)。將受孕母鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成 2組，1組9只孕鼠，在 E12天時(shí)給予母鼠 600 mg/kg的 VPA(用0.85%的生理鹽水配成 250 mg/mL的溶液)腹腔注射［5］，是為模型組；另外1組為1對，進(jìn)行正常飼養(yǎng)，是為空白對照組。模型組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為模型鼠；正常對照組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為正常對照組。第23天仔鼠雌雄分籠，按隨機(jī)數(shù)字法分組，1～9號為針刺“長強(qiáng)”穴組，10～19號為非針刺對照模型組，即模型組；20～29號為非穴位針刺治療組。正常對照組生下 12只，隨機(jī)篩選10只為空白對照組。

2.2 針刺干預(yù)

2.2.1 穴位選擇 參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［6］中的定位方法取長強(qiáng)穴：位于大鼠肛門和尾骨部之間的凹陷處；非穴為：在大鼠腋中線處，在肋弓最低點(diǎn)上1 cm非經(jīng)非穴處。

2.2.2 刺法 仔鼠生出 23天后，針刺長強(qiáng)穴組以 30號0.5寸毫針 (佳健牌，無錫佳健醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))直刺約0.2寸，非穴位針刺對照組同樣以30號0.5寸毫針直刺0.2寸，2組行平補(bǔ)平瀉提插手法1 min。每日于上午9時(shí)行針刺手法 1次，連續(xù)針刺10日為 1個(gè)療程，1個(gè)療程后休息 2日再行針刺治療，連續(xù) 3個(gè)療程。非針刺模型組、空白對照組僅每日模擬針刺組行抓取動(dòng)作，不作治療，并在相同條件下飼養(yǎng)。

2.3 Morris水迷宮行為學(xué)測試 水迷宮直徑為120 cm，深為50 cm，注入水深為 30 cm，水溫控制在 22℃～25℃，通過池壁上的4個(gè)等分距離點(diǎn)把水池分為4個(gè)象限，并在第三象限的中央放置一直徑為12 cm，略低于水平面1.5 cm的圓形黑色平臺。水迷宮定位航行試驗(yàn)：于每日上午9時(shí)開始，將大鼠沿著水池壁放入水中，從第一象限開始，通過圖像采集和處理系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺所用的時(shí)間及軌跡，若大鼠在60 s內(nèi)找到并站上平臺，就進(jìn)行下一象限測試，如果大鼠在60 s內(nèi)還未登上平臺，實(shí)驗(yàn)人員就幫助大鼠站上平臺，并在平臺上站立 10 s，10 s后讓老鼠置于鼠籠中休息 1 min，之后再進(jìn)行下一象限測試，第2日開始就從第2象限開始，以此類推，連續(xù)4日。

2.4 大鼠海馬區(qū)β-catenin和GSK-3β蛋白表達(dá)的觀察

2.4.1 樣品采集及處理 針刺治療結(jié)束后，參照如下方法進(jìn)行取材：抓取大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，待大鼠昏迷后，將其胸腔剪開，充分暴露心臟，并剪開大鼠的右心耳放血，同時(shí)將圓頭針插入大鼠心尖，迅速向心臟內(nèi)推注生理鹽水，直至觀察到從剪開的右心耳處流出清亮的液體為止，大約需推50 mL；隨后立即換針筒，保持針頭不移位，向心臟內(nèi)緩慢灌入4%的多聚甲醛，待大鼠的四肢、尾巴完全僵直時(shí)，拔出針頭，斷頭，從枕骨大孔往前剪開皮膚，沿人字縫分開顱骨，暴露腦組織，并迅速剝離腦膜及神經(jīng)，使之與顱骨分離，取出腦組織，浸沒于4%多聚甲醛液體中，參照大腦腦定位定向圖譜［7］，冠狀面切取前囟-3.14 mm～-6.3 mm部分約3 mm厚腦片，包埋切片后行免疫組化檢測：首先將組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜；之后進(jìn)行脫蠟、脫水；接下來進(jìn)行抗原修復(fù)及封閉。甩去多余液體，不洗；之后進(jìn)行滴加一抗、二抗和顯色，最后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，并在顯微鏡下觀察。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。平均逃避潛伏期：各組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)意義。

大鼠海馬區(qū) β-catenin和 GSK-3β蛋白表達(dá)的觀察：空白組、非針刺模型組、針刺長強(qiáng)穴組、非穴治療組組間采用圖片對比觀察，記錄陽性細(xì)胞率，采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)意義。

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮觀察結(jié)果 表1結(jié)果顯示：在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，針刺長強(qiáng)穴組與非針刺對照模型組相比，其逃避潛伏期所用時(shí)間明顯縮短（P＜0.05）；而空白對照組與非針刺對照模型組比，其所用時(shí)間也明顯縮短（P＜0.05），其結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠定位航行試驗(yàn)潛伏期比較 （x±s，s）

3.2 大鼠海馬區(qū)β-catenin和GSK-3β蛋白表達(dá)的觀察

3.2.1 大鼠海馬區(qū)β-catenin蛋白表達(dá)的觀察結(jié)果 表2結(jié)果顯示：針刺長強(qiáng)穴組與非針刺對照模型組相比，其海馬區(qū) β-catenin蛋白表達(dá)的陽性率明顯下調(diào)（P＜0.05）；而空白對照組與非針刺對照模型組比，其陽性細(xì)胞表達(dá)率也明顯下調(diào)（P＜0.05），其結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 大鼠海馬區(qū)β-catenin蛋白表達(dá)的陽性率比較 （x±s）

3.2.2 海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)的觀察結(jié)果 表3結(jié)果顯示：針刺長強(qiáng)穴組與非針刺對照模型組相比，其海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)的陽性率明顯上調(diào)（P＜0.05）；空白對照組與非針刺對照模型組、非穴治療組相比，其陽性細(xì)胞率明顯上調(diào)（P＜0.05），其結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)的陽性率比較（x±s）

4 分析與討論

兒童自閉癥，又稱兒童孤獨(dú)癥，是一種較為嚴(yán)重的發(fā)育障礙性疾病。研究認(rèn)為，在遺傳與環(huán)境因素的相互作用下，可引發(fā)個(gè)體發(fā)育早期階段神經(jīng)元細(xì)胞增殖、分化、凋亡與遷移異常，從而導(dǎo)致相關(guān)腦區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常［3］。通過大量的臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)針刺長強(qiáng)穴治療精神發(fā)育遲滯兒童，可提高患兒的語言、認(rèn)知能力和智力［8］。長強(qiáng)穴，又名尾閭穴，位于尾骨尖下0.5寸，尾骨端與肛門連線的中點(diǎn)處，為督脈之絡(luò)穴，別走任脈?！峨y經(jīng)·二十八難》中首先提出長強(qiáng)與腦的直接聯(lián)系，其指出：“督脈者，其余下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”。長強(qiáng)為督脈的第一個(gè)穴，這里的“下極之俞”指的應(yīng)該就是長強(qiáng)。所以可通過針刺長強(qiáng)，可起到通督調(diào)陽的作用，即“長強(qiáng)者長于陽而強(qiáng)于陰，生氣通于天，其質(zhì)造形而通于地”，為純陽初始，使臟中生春陽氣正，舒緩各部器官，具有很好的寧神鎮(zhèn)痙，脊強(qiáng)反折，除其癲疾之功效［9］。

Wnt通路是一條對個(gè)體的早期發(fā)育，是腦發(fā)育尤其重要的信號通路。Wnt信號在動(dòng)物胚胎的早期生長和形態(tài)發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關(guān)重要的作用［10］。多種神經(jīng)性疾病都可能與 Wnt信號通路的異常有關(guān)［11］。通路上的β-catenin作為一種黏附因子，功能主要為介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和參與基因的表達(dá)，在通路中處于關(guān)鍵地位。位于信號通路 β-catenin上游的GSK-3β是一個(gè)主要復(fù)興調(diào)節(jié)因子，阻止其下游的 βcatenin降解，使神經(jīng)元增值過快、數(shù)量增加，導(dǎo)致神經(jīng)元形成錯(cuò)誤的聯(lián)系［12］，從而使自閉癥患者表現(xiàn)出社會交往障礙、刻板行為模式及情緒焦慮等方面的異常［12］。本實(shí)驗(yàn)通過針刺干預(yù)自閉癥模型大鼠后，其長強(qiáng)穴治療組在水迷宮試驗(yàn)中其定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期所用的時(shí)間明顯縮短，表明針刺長強(qiáng)穴后自閉癥模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所提高；其海馬區(qū) Wnt通路上的 β-catenin表達(dá)下調(diào)、GSK-3β表達(dá)上調(diào)，從而使亢進(jìn)的Wnt通路趨于正常。這些指標(biāo)提示從腦內(nèi)在結(jié)構(gòu)到外在行為表現(xiàn)都說明針刺長強(qiáng)穴對自閉癥模型大鼠具有治療作用。觀察這兩個(gè)信號蛋白在大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)的蛋白表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)的變化，以希望認(rèn)識到這些變化與學(xué)習(xí)記憶功能改善之間的相關(guān)性，但其具體作用機(jī)制尚不明了，有待進(jìn)一步研究其相關(guān)性。