權(quán)春梅，曹 帥，丁瑞蘋，劉超祥，張晴晴，周光姣

（1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 亳州 236800；2.亳州學(xué)院 中藥學(xué)院，安徽 亳州 236800）

芍花為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的花，花色艷麗、香氣濃郁，有“一花之下，萬花之上”的美稱。芍花有較高的藥用價(jià)值，有抗氧化，抗菌、抗病毒，抗癌，抗神經(jīng)退行性疾病，抗心血管疾病和抗腎臟、肺纖維化，抗炎活性[1]，同時(shí)具有很高的活性氧自由基的清除能力，富含總酚類、黃酮類、多糖物質(zhì)等活性成分[2]。但是芍花常常被作為廢棄物丟掉而造成極大的浪費(fèi)。因此對芍花的開發(fā)利用勢在必行。芍花一般4月底或5月初花朵初開，先是花蕾期，而后進(jìn)入盛開期。當(dāng)前，有不少國內(nèi)外學(xué)者對很多花卉精油的提取工藝及抗氧化活性成分進(jìn)行了研究[3-7]，但是對不同花期芍花精油的成分及活性研究尚未見報(bào)道。

文章利用超臨界CO2流體萃取法對花蕾期和盛開期芍花進(jìn)行精油的提取，采用氣-質(zhì)聯(lián)用色譜法對其進(jìn)行成分研究，對比兩種花期芍花精油的成分差異；另外，采用DPPH法和ABTS法對以上兩種花期的芍花精油進(jìn)行抗氧化活性研究，為芍花的采收期提供依據(jù)，同時(shí)也為芍花精油作為天然抗氧化劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

芍花，采收于安徽省亳州市譙東鎮(zhèn)，經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院劉耀武教授鑒定為芍藥Paeonia lactifloraPall.的花；CO2（食品級，純度99%以上）；無水乙醚（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20170803）；無水硫酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20160809）；DPPH（Sigma公司，批號：43654-357）；ABTS（Sigma公司，批號：30931-67-0）；磷酸二氫鈉（天津市博迪化工有限公司，批號：20170706）；磷酸氫二鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：20170312）；過二硫酸銨（江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，批號：20160915）；無水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：20170312）；娃哈哈純凈水（合肥娃哈哈飲料有限公司）。

1.1.2 儀器

超臨界萃取裝置（HA220-50-06，江蘇南通華安超臨界萃取公司）；搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（DFY-400，溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；電子計(jì)重計(jì)數(shù)天平（LQ-1230，上?，幮码娮涌萍加邢薰荆?；電子天平（FA21048，上海菁海儀器有限公司）；蒸餾裝置（上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；UV紫外分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；Trace1310型氣相色譜儀與ISQ單四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 超臨界CO2流體萃取法

依據(jù)權(quán)春梅[8]等人對超臨界CO2流體萃取芍花精油的方法研究，設(shè)置萃取條件分別為萃?、駢毫?2 MPa、萃?、駵囟?5 ℃、分離Ⅰ溫度36.5 ℃、分離Ⅱ溫度35.7 ℃及泵頻率15 Hz，萃取得芍花精油。

1.2.2 芍花精油的GC-MS測定

采用石英毛細(xì)管柱TG-5MS，30 m×0.25 mm，載氣為He。程序升溫從40 ℃開始，以4 ℃/min升到150 ℃保持5 min，再以6 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min，載氣He，柱流量1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比80∶1。

質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓70 Ev，離子源溫度230 ℃，掃描質(zhì)量范圍（m/z）：30～500。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定

將花蕾期和盛開期的芍花精油、BHT試劑，用無水乙醇作為溶劑，配成濃度分別為1.25、3.12、6.25、12.5、25.0、50.0 mg/L的樣品溶液，參照文獻(xiàn)[12]方法測定待測樣品對DPPH自由基的清除能力。于光徑1 cm的比色皿管內(nèi)加入6.5×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液2.5 mL，再加入0.5 mL待測樣品溶液，搖勻，室溫下避光放置20 min后測定混合溶液在517 nm處的吸光度。每一濃度下的吸光度平行測3次，結(jié)果平均值，清除活性按下式計(jì)算：

式中：A1為DPPH溶液2.5 mL+樣品乙醇溶液0.5 mL的吸光度；A2為樣品乙醇溶液0.5 mL+無水乙醇2.5 mL的吸光度；A0為DPPH溶液2.5 mL+無水乙醇0.5 mL。公式中引入A2是為了消除樣品溶液本身顏色對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

1.2.4 ABTS自由基清除率的測定

ABTS自由基清除能力的測定參照文獻(xiàn)[9-11]的方法，用蒸餾水將ABTS配制成7 mmol/L儲備液，將上述儲備液與2.45 mmol/L（NH4）2S2O8水溶液混合均勻，于室溫避光16 h后備用，反應(yīng)產(chǎn)生ABTS自由基，將ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液（5 mmol/L，pH7.4）稀釋，使其在734 nm下測得吸光度A在0.700±0.020，用無水乙醇將將花蕾期和盛開期的芍花精油、BHT試劑，配成濃度分別為1.25、3.12、6.25、12.5、25.0、50.0 mg/L的樣品溶液，將0.5 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液與5 mL ABTS+自由基溶液充分混勻，在室溫下放置10 min后每隔5 min測其吸光度A樣品，按下式計(jì)算清除率：

A樣品為加樣品溶液后的ABTS+自由基溶液的吸光度，A空白為不加樣品溶液ABTS自由基溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾期芍花精油的GC-MS分析

花蕾期芍花精油的GC-MS總離子流色譜圖如圖1。

圖1 花蕾期芍花精油的總離子流色譜圖

通過對圖1的分析結(jié)合計(jì)算機(jī)檢索得出該芍花精油含有8種主要化學(xué)成分，結(jié)果見表1。

表1 花蕾期芍花精油的主要成分及含量

由表1可以看出，花蕾期芍花精油的主要成分 為[S-（R*，S*）]-N-（3-氨 基-2-羥 基-1-氧代-4-苯丁基）-L-亮氨酸（烏苯美司），含量高達(dá)63.22%，除此之外還有苯甲酸，相對含量為19.92%，另外含有少量的其他醇。

2.2 盛開期芍花精油的GC-MS分析

盛開期芍花精油的總離子流色譜圖如圖2。

圖2 盛開期芍花精油的總離子流色譜圖

通過對圖2的分析結(jié)合計(jì)算機(jī)檢索可以得出該芍花精油含有10種主要化學(xué)成分，結(jié)果見表2。

表2 盛開期芍花精油的主要成分及含量

由表2可以看出，盛開期芍花精油的主要成分為3-甲基-1，6-庚二烯-3-醇，含量達(dá)45.69%，另外還含有13.16%的苯甲酸，除此之外還含有其他的醇類及少量的酮。

2.3 不同花期芍花精油對DPPH自由基的清除能力

通過實(shí)驗(yàn)得出花蕾期和盛開期芍花精油對DPPH自由基的清除率結(jié)果見圖3。

圖3 清除DPPH自由基的能力

通過圖3可以看出兩種花期的芍花精油對DPPH自由基的清除能力均隨著精油濃度的增大而增強(qiáng)，相同濃度下花蕾期的芍花精油對DPPH自由基的清除能力稍高于盛開期的芍花精油，但二者對DPPH自由基的清除率均小于BHT。在1.56-50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，以α=0.05檢驗(yàn)水平，兩者對DPPH自由基的清除率整體差異明顯。

2.4 不同花期芍花精油對ABTS自由基的清除能力

通過實(shí)驗(yàn)得出花蕾期和盛開期的芍花精油對ABTS自由基的清除率結(jié)果見圖4。

圖4 清除ABTS自由基的能力

通過圖4可以看出兩種花期的芍花精油對ABTS自由基的清除率能力均隨著精油濃度的增大而增強(qiáng)，相同濃度下花蕾期的芍花精油對ABTS自由基的清除能力明顯高于盛開期的芍花精油，但二者對ABTS自由基的清除率均小于BHT。在1.56-50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，以α=0.05檢驗(yàn)水平，兩者對ABTS自由基的清除率整體差異明顯。

3 結(jié)論

通過以上實(shí)驗(yàn)可以看出，花蕾期和盛開期的芍花精油的成分差異很大，花蕾期芍花精油的主要成分為[S-（R*，S*）]-N-（3-氨基-2-羥基-1-氧代-4-苯丁基）-L-亮氨酸（烏苯美司），該成分具有提高免疫力的功能，臨床上常用于抗癌化療、放療的輔助治療，老年性免疫功能缺陷等。因此，對于花蕾期芍花精油進(jìn)一步的分離及研究將具有重要意義。

以上實(shí)驗(yàn)研究也表明，在相同濃度下花蕾期的芍花精油對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力均高于盛開期的芍花精油。另外，兩種花期的芍花精油對ABTS自由基的清除能力均高于對DPPH自由基的清除能力。綜合課題組利用超臨界CO2流體萃取法對不同花期芍花精油提取率的研究，從經(jīng)濟(jì)效益及抗氧化活性的角度考慮，建議芍花的采收期為花蕾期。

芍花精油作為一種天然抗氧化劑將有很大的潛能，在化妝品、食品、醫(yī)療、化工等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。該研究為芍花的采收期及芍花精油的抗氧化研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為提升芍花的附加值拓寬了途徑。