陳紅惠，李霖娜，聶秋月

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

底圩茶原產(chǎn)于馱娘江和西洋江發(fā)源地的“九龍山”山脈，因最早出產(chǎn)于底圩鄉(xiāng)而得名，是云南省廣南縣地方優(yōu)良茶樹(shù)品種，是優(yōu)質(zhì)中國(guó)名茶之一。底圩茶品質(zhì)獨(dú)特，具有品種、品牌、加工、基地和市場(chǎng)等方面的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為廣南縣茶葉產(chǎn)業(yè)重要組成部分。

近年來(lái)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有較強(qiáng)抗氧化能力，可清除體內(nèi)自由基，還有抗菌、消炎等作用[1-4]。茶葉中的主要功效成分之一是以茶多酚為主的黃酮類化合物，為考察底圩茶資源可利用性，對(duì)廣南地區(qū)底圩茶中黃酮進(jìn)行提取，探討底圩茶黃酮的最佳提取工藝。通過(guò)對(duì)底圩茶的黃酮成分提取研究，可以為深入開(kāi)發(fā)底圩茶提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

底圩茶 購(gòu)自云南省文山州廣南縣；蘆丁（上海時(shí)代生物科技有限公司）；乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HOC-DZH烘箱（上海恒黔電子科技有限公司）；W201D恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；XS225A電子天平（precise儀器有限公司）；V-1100D型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將底圩茶粉碎過(guò)篩，儲(chǔ)存于干燥棕色瓶中備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取烘至恒量的蘆丁20.00 mg，加入少量80%乙醇溶解，定容至100 mL，配制得到濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別準(zhǔn)確吸取上述濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL移入50 mL容量瓶中，將上述容量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中各加入80%乙醇至2.0 mL，加入5%亞硝酸鈉1.5 mL，搖勻后靜置5 min，加入10%硝酸鋁1.0 mL，搖勻后放置5 min，再加5%氫氧化鈉10 mL，用80%乙醇定容至刻度，搖勻后，放置10 min，同時(shí)作空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定吸光值，以蘆丁的含量為橫坐標(biāo)，吸光值的大小為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[5-9]，得到回歸方程：y=5.3571x-0.0001，其中：R2=0.9999，表明測(cè)定的吸光值與蘆丁含量呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 樣品提取及含量測(cè)定

用電子天平準(zhǔn)確稱取一定量的底圩茶樣品，加入一定濃度的乙醇進(jìn)行提取，冷卻、過(guò)濾后定容，得測(cè)定用樣液。吸取一定體積樣液按1.3.2法測(cè)定吸光度，然后根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中黃酮含量。

1.3.4 提取條件的選擇

先對(duì)影響提取實(shí)驗(yàn)的乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)這幾個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[10-16]，然后根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇主要因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定底圩茶黃酮最佳提取工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)底圩茶黃酮提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g底圩茶粉5份，采用料液比為1∶30（m∶v），乙醇濃度為70%，分別在不同溫度條件下提取30 min，提取1次，不同溫度條件對(duì)底圩茶黃酮提取量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1 不同提取溫度提取量的影響

一般說(shuō)來(lái)，溫度升高能促使溶劑滲透、擴(kuò)散速度加快，提取物的溶出量也會(huì)隨之增加，但過(guò)高溫度可能引起黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被氧化破壞導(dǎo)致其提取含量降低。由圖1可看出，當(dāng)提取溫度低于70 ℃時(shí)，提取黃酮含量隨提取溫度升高而增加，當(dāng)提取溫度大于70 ℃時(shí)，提取黃酮含量隨提取溫度升高而逐漸下降，所以在70 ℃時(shí)底圩茶黃酮提取效果最好，提取量可達(dá)22.31 mg/g。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)底圩茶黃酮提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g底圩茶粉5份，在料液比為1∶30（m∶v），提取溫度為70 ℃，提取30 min條件下，改變乙醇不同濃度以考察其對(duì)底圩茶黃酮提取量影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)提取量的影響

一般來(lái)說(shuō)，溶劑濃度越高，提取物浸出量也越多，但過(guò)高的濃度也會(huì)增加雜質(zhì)的溶出。由圖2可看出，乙醇濃度增加達(dá)70%時(shí)，黃酮提取量最大，達(dá)到20.96 mg/g；然后乙醇濃度再增加，黃酮提取含量卻出現(xiàn)減少，故提取底圩茶黃酮的最佳乙醇濃度為70%。

2.1.3 料液比對(duì)底圩茶黃酮提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g底圩茶粉5份，加入70%乙醇，在70 ℃溫度下提取30 min，提取1次，改變不同料液比考察其對(duì)底圩茶黃酮提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同液料比對(duì)黃酮提取量的影響

由圖3可看出，當(dāng)料液比小于1∶60（m∶v）時(shí)，提取黃酮含量隨料液比增加而增加，當(dāng)料液比超過(guò)1∶60（m∶v）時(shí)，提取黃酮含量出現(xiàn)下降，所以底圩茶黃酮提取的最佳料液比為1∶60（m∶v），此時(shí)的提取含量為27.36 mg/g。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)底圩茶黃酮提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g底圩茶粉5份，提取溫度為70 ℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶60（m∶v，分別在提取時(shí)間為30、40、50、60、70 min下提取1次，考察不同提取時(shí)間對(duì)底圩茶黃酮提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響

由圖4可看出，在提取時(shí)間低于50 min時(shí)，黃酮提取量隨提取時(shí)間增加而增加，當(dāng)提取時(shí)間大于50 min時(shí)，黃酮提取量卻下降，因此50 min是提取底圩茶黃酮的最佳時(shí)間，此時(shí)的提取含量25.96 mg/g。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)底圩茶黃酮提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g干燥的底圩茶粉4份，在提取溫度為70 ℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶60（m∶v），提取時(shí)間為50 min下分別提取1、2、3、4次，考察不同提取次數(shù)對(duì)底圩茶黃酮提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同提取次數(shù)對(duì)黃酮提取量的影響

從圖5可看出，當(dāng)提取次數(shù)小于3次時(shí)，隨著提取次數(shù)不斷增加，提取黃酮含量也隨著增加，當(dāng)提取次數(shù)大于3次時(shí)，提取黃酮含量趨于平衡，由于提取2次時(shí)的黃酮含量比提取1次時(shí)的高1.12 mg/g，提取3次時(shí)的黃酮含量比提取2次時(shí)的高0.19 mg/g，再考慮相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)成本和工作效率，提取2次遠(yuǎn)比提取3次好，所以，2次是提取底圩茶黃酮的最佳次數(shù)，此時(shí)的提取含量26.80 mg/g。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化底圩茶黃酮提取工藝參數(shù)

依據(jù)以上單因素試驗(yàn)情況，優(yōu)選提取工藝條件選擇乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、提取時(shí)間（D）4個(gè)因素、每個(gè)因素，設(shè)定3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)來(lái)確定底圩茶中黃酮最佳提取條件[17-21]，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2中極差R大小可看出，各因素對(duì)底圩茶黃酮提取效果影響的大小順序是：RB＞RA＞RD＞RC，即提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比；最佳的水平組合應(yīng)為A1B1C1D1即乙醇濃度為60%、溫度為60 ℃、料液比1∶50（m∶v）、提取時(shí)間為40 min。因此，確定生產(chǎn)底圩茶黃酮的提取工藝條件為：底圩茶葉洗凈，60 ℃烘至恒重后，粉碎，用60%乙醇于60 ℃條件下提取2次，每次40 min。

2.3 最佳提取工藝條件的驗(yàn)證

依據(jù)正交所得出底圩茶黃酮的最佳提取工藝條件，進(jìn)行了三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃酮提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表3可知，在乙醇濃度為60%、溫度為60 ℃、料液比1∶50（m∶v）、提取時(shí)間為40 min條件下提取2次，黃酮提取含量達(dá)36.49 mg/g，均高于其他提取條件下水平的提取含量。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)底圩茶黃酮提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，影響底圩茶黃酮提取效果的因素中提取溫度是最主要的影響因素，其次為乙醇濃度，影響最小的因素是料液比。底圩茶黃酮最佳提取條件為：在料液比1∶50（m∶v）條件下，用濃度為60%乙醇60 ℃下提取40 min，提取2次，在此最優(yōu)提取工藝條件下，底圩茶黃酮提取含量為36.49 mg/g。本試驗(yàn)對(duì)底圩茶黃酮類化合物的提取研究提供理論依據(jù)，具有一定指導(dǎo)意義，對(duì)底圩茶的進(jìn)一步深加工具有促進(jìn)作用，也為底圩茶進(jìn)一步純化和活性研究奠定了基礎(chǔ)。