馮 濤 ， 李素芳 ， 毛夢(mèng)嬌 ， 邵柔銘 ， 潘家榮 *

（1.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310018；2.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 海洋食品加工質(zhì)量控制技術(shù)與儀器國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310018）

肉制品摻假現(xiàn)象已成為我國(guó)食品行業(yè)重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。諸多媒體報(bào)道，不法商販?zhǔn)褂昧畠r(jià)肉類摻入或直接代替價(jià)值更高的牛羊肉進(jìn)行食品加工及銷售，嚴(yán)重侵害消費(fèi)者的利益。豬肉是我國(guó)食用最廣泛的肉類之一，其價(jià)格相對(duì)于牛羊肉更便宜。而信仰伊斯蘭教的穆斯林民族的飲食習(xí)慣又嚴(yán)禁豬肉源性成分的混入。肉類加工制品琳瑯滿目、種類繁多，難以通過(guò)感官進(jìn)行分辨。因此對(duì)工商、食品安全部門而言，建立有效的肉類加工制品中豬源性成分的定性鑒定方法，對(duì)摻假不法行為的監(jiān)管與打擊十分必要。這有助于保證廣大消費(fèi)者的健康及促進(jìn)民族和諧。

核酸擴(kuò)增技術(shù)[1]是有效鑒別動(dòng)物源性成分的方法。高琳等利用線粒體DNA Cyt b基因PCR-RFLP技術(shù)成功鑒別豬肉和牛肉[2]，周彤等使用熒光定量PCR方法檢測(cè)肉制品中豬源性成分[3]，國(guó)外也有諸多利用PCR方法對(duì)鴨、牛、羊等動(dòng)物進(jìn)行物種鑒定的報(bào)道[4-6]。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也越來(lái)越多地應(yīng)用于動(dòng)物源性成分的鑒定，以LAMP為基礎(chǔ)的擴(kuò)增方法被廣泛使用和研發(fā)[7-8]。

交 叉 引 物 等 溫 擴(kuò) 增 （Crosspriming amplification，CPA）是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。通過(guò)對(duì)CPA的兩條特定引物進(jìn)行分子標(biāo)記，使擴(kuò)增產(chǎn)物成為擁有兩個(gè)特定結(jié)合位點(diǎn)的 “抗原”[9]。這種方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被大量用于檢測(cè)細(xì)菌、病毒、病原體等[10-13]。但在動(dòng)植物鑒定方面還少有報(bào)道，因此CPA-核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)在食品摻假方面具有研究和使用前景。

mtDNA是高等動(dòng)物的核外遺傳物質(zhì)，單細(xì)胞中含有多個(gè)線粒體，線粒體中，基因的數(shù)量少，基因拷貝數(shù)多，且具有種內(nèi)和種間多態(tài)性[14-15]，拷貝數(shù)大。而細(xì)胞核DNA中基因的數(shù)量龐大，單拷貝的基因居多，在深加工肉制品[16]中單拷貝的基因更容易丟失。因此mtDNA較細(xì)胞核DNA更適合作用檢測(cè)目標(biāo)。本研究在分析牛、羊、豬、鴨、雞線粒體DNA D-loop基因[17]序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)用于肉制品中豬源性成分檢測(cè)的CPA引物體系，擬建立豬源性成分定性檢測(cè)的交叉引物等溫?cái)U(kuò)增-核酸試紙條檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所使用的動(dòng)物樣本（牛、羊、雞、鴨、豬）購(gòu)自杭州大型超市；實(shí)驗(yàn)用引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；核酸試紙條購(gòu)自杭州尤思達(dá)生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用核酸試紙條為膠體金免疫試紙條，其中加樣區(qū)包含膠體金-親和素復(fù)合物，檢測(cè)線（T線）包埋熒光素的抗體，質(zhì)控線（C線）包埋生物素。使用時(shí)，用移液器吸取10 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物滴入試紙條加樣區(qū)，將試紙條插入2×SSC緩沖液中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 儀器和設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀、Nanodrop-2000電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 總DNA的制備

用DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，方法參照使用手冊(cè)。將制備好的DNA用ND-2000核酸蛋白分析儀檢測(cè)，并將其質(zhì)量濃度調(diào)整為約100 ng/μL。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因比對(duì)和CPA引物設(shè)計(jì)

在 GenBank上整理鴨、牛、羊、雞、豬線粒體DNA D-loop基因的序列。同種動(dòng)物不同個(gè)體之間的D-loop基因存在一定水平的遺傳多樣性，在CPA引物設(shè)計(jì)中需要考慮到這種差異。故通過(guò)比對(duì)GenBank上已公布的豬D-loop基因序列，在CPA引物設(shè)計(jì)時(shí)盡量避開突變位點(diǎn)，以保證CPA系統(tǒng)的通用性和有效性。對(duì)豬源D-loop基因上特異性片段序列設(shè)計(jì)CPA引物組并實(shí)驗(yàn)篩選。

1.5 CPA引物與探針的篩選及體系優(yōu)化

1.5.1 引物與探針的篩選 對(duì)1.4節(jié)中設(shè)計(jì)的CPA引物組進(jìn)行初步篩選，將1.3節(jié)中提取的豬DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，將提取的牛、羊、鴨、雞4種常見畜禽肉的總DNA以及無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，所有DNA模板均使用ddH2O稀釋至100 ng/μL。篩選反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)溫度預(yù)設(shè)63℃，反應(yīng)60 min。擴(kuò)增結(jié)束，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸電泳和試紙條分別進(jìn)行檢測(cè)。

表1 20 μL CPA初始反應(yīng)體系Table 1 20 μL CPA initial reaction system

1.5.2 引物與探針濃度的優(yōu)化 以CPA反應(yīng)體系中的交叉引物2a1s和探針（2a/3a）的質(zhì)量濃度作為變量，設(shè)計(jì)引物質(zhì)量濃度交叉實(shí)驗(yàn)。在研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)交叉引物2a1s質(zhì)量濃度≥探針2a/3a質(zhì)量濃度時(shí)擴(kuò)增效果較好，設(shè)計(jì)18組質(zhì)量濃度配比實(shí)驗(yàn)（見表2），每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中設(shè)立3個(gè)平行陰性實(shí)驗(yàn)（以無(wú)菌水為模板）和3個(gè)平行陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)（以100 ng/μL豬的總DNA為模板）。

表2 CPA引物濃度交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Concentration cross experiment of CPA primers

1.5.3 引物體系的特異性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對(duì)1.5.2節(jié)中擴(kuò)增結(jié)果理想的引物濃度組合，以豬的總DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以牛、羊、鴨、雞的總DNA以及無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，進(jìn)行CPA擴(kuò)增引物特異性實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳和核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)，比較結(jié)果。

對(duì)特異性良好的實(shí)驗(yàn)組，后續(xù)進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。設(shè)立3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)重復(fù)組分別設(shè)立6個(gè)平行陰性實(shí)驗(yàn)和6個(gè)平行陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)。總計(jì)18個(gè)陰性實(shí)驗(yàn)及18個(gè)陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均正確的實(shí)驗(yàn)組為本次研究的最佳引物體系。

1.6 CPA擴(kuò)增靈敏度實(shí)驗(yàn)

將保存的豬DNA樣品梯度稀釋（10倍稀釋）成100、10、1、1×10-1ng/μL。 用 1.5 節(jié)中篩選優(yōu)化的CPA反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增靈敏度實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)產(chǎn)物用電泳和試紙條分別進(jìn)行檢測(cè)，以確定CPA反應(yīng)體系對(duì)單一成分豬肉DNA的靈敏度。

1.7 混合肉中豬肉成分的檢測(cè)

將豬肉按比例 （50% 、20%、10%、5%、1% 、0%）與牛肉進(jìn)行混合，用SDS動(dòng)物組織DNA提取方法[18-19]提取總DNA，并將混合DNA質(zhì)量濃度調(diào)整至100 ng/μL，作為模板進(jìn)行CPA擴(kuò)增，產(chǎn)物使用核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)，研究肉類混合對(duì)檢出限的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性片段序列及CPA引物

1.4節(jié)中設(shè)計(jì)的CPA引物組，經(jīng)過(guò)1.5節(jié)實(shí)驗(yàn)篩選后最終的引物組合見表3。圖1為設(shè)計(jì)引物所使用的特異性片段序列，同時(shí)各引物在序列上對(duì)應(yīng)的位置也如圖1所示。比較圖中牛、羊、豬的片段序列可以發(fā)現(xiàn)，本引物系統(tǒng)的特異性主要體現(xiàn)在引物Sus Dlp 2s1a的3端。

表3 豬源檢測(cè)CPA系統(tǒng)引物表Table 3 Nucleotide sequences of the primers of Sus CPA

表4為通過(guò)1.5節(jié)篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化后確定的最佳反應(yīng)體系。

2.2 CPA擴(kuò)增特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以鴨、羊、牛、豬、雞DNA為模板按表4最佳反應(yīng)條件進(jìn)行CPA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)果如圖2所示。以水為模板的陰性對(duì)照電泳圖中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明引物間不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)；以豬DNA為模板的CPA擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳下檢測(cè)出階梯狀核酸條帶，在100 bp左右位置出現(xiàn)兩條清晰的電泳條帶，此為CPA擴(kuò)增的特征條帶，條帶的位置根據(jù)引物設(shè)計(jì)位置不同有所差異；以羊、牛、鴨、雞DNA為模板的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示有核酸片段產(chǎn)物（彌散亮帶），但無(wú)CPA特征條帶。在2.1節(jié)中已指出，本引物組合的特異性主要體現(xiàn)在引物Sus Dlp 2s1a上，其他4條引物不具有高特異性，只作為CPA必要引物存在。在擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中這4條引物也能以羊、牛、鴨、雞DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。但在缺少引物Sus Dlp 2s1a的擴(kuò)增產(chǎn)物前提下，羊、牛、鴨、雞DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與豬DNA擴(kuò)增結(jié)果不同。結(jié)果表明本引物系統(tǒng)具有良好的特異性，只對(duì)豬源性成分具有完整的CPA擴(kuò)增，其他模板只能進(jìn)行部分?jǐn)U增反應(yīng)。

圖1 豬線粒體D-loop基因中目標(biāo)片段及引物位置Fig.1 Nucleotide sequence alignment of the target regions of D-loop gene in pork mtDNA.Arrows indicate the primers used for CPA assays

表4 20 μL CPA最佳反應(yīng)體系Table 4 20 μL CPA best reaction system

核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果（圖3）中只有豬DNA對(duì)應(yīng)的試紙條上檢測(cè)線顯示為紅色，其他模板對(duì)應(yīng)的試紙條上檢測(cè)線不顯示紅色。核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果與電泳結(jié)果一致，核酸試紙條能對(duì)豬DNA的CPA擴(kuò)增產(chǎn)物正確檢測(cè)。在120 V電壓下，電泳系統(tǒng)工作30～40 min后呈現(xiàn)的電泳條帶最為理想，而使用核酸試紙條檢測(cè)，只需3～5 min即可完成加樣到最終的結(jié)果觀察的過(guò)程。

圖2 豬源CPA系統(tǒng)擴(kuò)增特異性電泳圖Fig.2 Analysis of pork DNA by CPA with agarose gel electrophoresis

N-空白對(duì)照；S-豬模板；B-牛模板；O-羊模板；G-雞模板；A-鴨模板

2.3 CPA擴(kuò)增靈敏度

CPA反應(yīng)體系對(duì)單一成分豬DNA檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，模板質(zhì)量濃度為100、10、1 ng/μL時(shí)，核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在研究設(shè)計(jì)并優(yōu)化的CPA反應(yīng)體系下，質(zhì)量濃度大于等于1 ng/μL的豬DNA模板能被準(zhǔn)確識(shí)別并進(jìn)行擴(kuò)增，電泳條帶及試紙條檢測(cè)結(jié)果明顯一致。當(dāng)模板質(zhì)量濃度小于1 ng/μL時(shí)，本系統(tǒng)不能準(zhǔn)確進(jìn)行檢測(cè)。

圖4 豬源CPA系統(tǒng)梯度稀釋模板擴(kuò)增產(chǎn)物試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Nucleic acid strip test of CPA products targeting the plasmid with different folds

2.4 混合肉中豬肉成分檢測(cè)結(jié)果

混合肉中不同豬肉比例的CPA檢測(cè)結(jié)果見圖5及表5。表5中當(dāng)豬肉含量在10%以上時(shí)，CPA擴(kuò)增方法能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出樣品中的豬源性成分；當(dāng)豬肉成分比例在10%以下時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，表現(xiàn)為檢測(cè)線顏色很淺或不限色，如圖5中試紙條4的檢測(cè)線存在少量紅色，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物中有雙標(biāo)記的CPA產(chǎn)物但產(chǎn)量極低。在不考慮取樣誤差的前提下，100 ng/μL的 10%混合樣品DNA提取液中豬DNA的質(zhì)量濃度為10 ng/μL，即當(dāng)檢測(cè)樣品中豬DNA的質(zhì)量濃度大于等于10 ng/μL時(shí)本方法可以檢測(cè)出混合樣品中的豬源性成分。比較1.6與1.7節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，混合肉中豬肉成分的檢出限（10 ng/μL）要低于單豬肉成分的檢出限（1 ng/μL），相差約為一個(gè)數(shù)量級(jí)（10倍）。相關(guān)的動(dòng)物源性成分檢測(cè)研究報(bào)道中，混合制品的檢出限一般在10%以下，楊冬燕等在多重?zé)晒釶CR鑒定羊肉摻假實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)確檢測(cè)出最低摻假比例為7%的樣品[20]；周如華等借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)羊肉制品中鼠源性成分的檢測(cè)限則為1%[21]。這是由于本研究中設(shè)計(jì)的CPA引物中部分引物具有通用性，混合肉中的其他肉成分DNA能與這部分引物進(jìn)行反應(yīng)，與豬DNA競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)消耗引物。競(jìng)爭(zhēng)性消耗在豬DNA含量越低時(shí)越明顯。在本團(tuán)隊(duì)研究的鴨源成分CPA檢測(cè)研究中混合制品的檢出限達(dá)到1%（未發(fā)表）。因此，豬源CPA反應(yīng)體系仍存在改進(jìn)空間，檢測(cè)靈敏度需進(jìn)一步提高。

圖5 混合肉中不同比例豬肉成分的檢出限Fig.5 Limit of detection in different ratio meat mixtures

表5 不同比例混合豬肉的CPA檢測(cè)結(jié)果（n=3）Table 5 Results of CPA of pork meat mixtures（n=3）

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究建立了豬源性交叉引物等溫?cái)U(kuò)增-核酸試紙條方法。該方法與鴨、羊、牛、豬、雞無(wú)交叉反應(yīng)，具有檢測(cè)特異性，能夠正確檢測(cè)出樣品中是否含有豬源性成分。對(duì)于單一豬肉源樣品，檢出限可以達(dá)到1 ng/μL。對(duì)混合肉制品中豬源成分占10%時(shí)，相當(dāng)于豬DNA質(zhì)量濃度大于10 ng/μL時(shí)使用本方法可以穩(wěn)定地檢出。本方法仍有較大的改進(jìn)空間。