王麗婷，郭會(huì)明，洪厚勝

(1.南京工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，南京 211816；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816)

醋酸菌是一大類革蘭氏陰性、嚴(yán)格需氧菌，主要棲息于含糖、酸或乙醇的原料中[1]。從1989年醋酸桿菌屬(Acetobacter)被Beijerinck提出到目前為止，一共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)醋酸菌屬，其中Acetobacter，Gluconobacter，Gluconacetobacter，Asaia，Komagataeibacter5個(gè)屬中均含有大量不同的菌種[2,3]。醋酸菌綱的微生物是嚴(yán)格需氧的，氧在呼吸代謝中是電子的最終受體，醋酸菌中除Asaia外，都能通過呼吸作用氧化乙醇，最終產(chǎn)生醋酸[4]。對(duì)醋酸菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)、保存、鑒定，篩選出高產(chǎn)酸的醋酸菌菌種，對(duì)生產(chǎn)高酸度醋具有重要的指導(dǎo)作用。

高酸度醋是指總酸含量為9%～25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的釀造醋，具有殺菌效果好、保鮮時(shí)間長、成本較低等優(yōu)勢[5]。采用液態(tài)深層發(fā)酵法直接轉(zhuǎn)化食用酒精為醋酸是生產(chǎn)高酸度醋的重要方法[6]。我國高酸度醋的生產(chǎn)水平與世界先進(jìn)水平相比仍有較大差距，而生產(chǎn)高酸度醋的關(guān)鍵是要掌握菌種、工藝、設(shè)備等方面的先進(jìn)技術(shù)[7]。本文主要對(duì)高產(chǎn)酸菌種的選育和醋酸菌的耐酸機(jī)制進(jìn)行了綜述，為高酸度醋生產(chǎn)菌種的選育提供了研究思路。

1 高產(chǎn)酸菌種的篩選方法

1.1 自然選育

傳統(tǒng)的篩選優(yōu)良菌種的方法是采集發(fā)酵中的醋醅，進(jìn)行梯度稀釋得到不同濃度的發(fā)酵培養(yǎng)液，在含有碳酸鈣的分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以在平板上產(chǎn)生透明圈的菌株，即為產(chǎn)酸的醋酸菌，然后進(jìn)行初篩，對(duì)那些形態(tài)優(yōu)良、H/C(透明圈直徑與菌落直徑的比值)值較大的單菌落劃線純化培養(yǎng)，并斜面保藏，對(duì)初篩的菌種進(jìn)行產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)及產(chǎn)酸量測定，對(duì)高產(chǎn)酸的菌株劃線純化培養(yǎng)后并保藏[8]。

陳洋等從工業(yè)醋醅中分離篩選出5株耐乙醇、耐高溫的醋酸菌菌株，通過發(fā)酵性能測定，發(fā)現(xiàn)其中FY4的耐受性最強(qiáng)，進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在相同條件下FY4發(fā)酵特性始終優(yōu)于工業(yè)菌株AS1.41，在37 ℃、10%乙醇的條件下，工業(yè)菌株AS1.41幾乎停止產(chǎn)酸，而FY4仍有較高的產(chǎn)酸量[9]。

用這種傳統(tǒng)的自然選育方法，使醋醅中的混合菌分離開，篩選出性狀優(yōu)良的高產(chǎn)酸菌株，這種方法簡便易行，但是醋醅中的醋酸菌自然突變率很低，往往篩選得到的菌種的性狀遠(yuǎn)不及食醋釀造工業(yè)上常用的純種AS1.41和滬釀1.01。

1.2 誘變育種

誘變育種是使用化學(xué)方法或物理方法對(duì)菌株進(jìn)行誘變，目的是定向篩選出所需優(yōu)良性狀的菌株。

賀小賢等對(duì)保藏的某菌株先進(jìn)行微波誘變篩選出較高產(chǎn)酸的菌株，再用化學(xué)試劑鹽酸羥胺進(jìn)行誘變，最終篩選出的突變株的產(chǎn)酸量提高了43.55%[10]。彭桂蘭等將通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法得到的2種醋酸菌的菌懸液，放在波長為253.7 nm、15 W的紫外光下照射一定的時(shí)間，紫外誘變后得到的2種醋酸菌的產(chǎn)酸率都得到了提高[11]。吳曉英利用室溫等離子體誘變技術(shù)選育了1株乙醇耐受性菌株，該菌株的醋酸產(chǎn)量比原始菌株提高了近4倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該誘變菌株與原始菌株相比，細(xì)胞膜通透性變小，海藻糖合成量變大[12]。

誘變育種選育醋酸菌操作簡單，突變頻率高，有利于篩選新的優(yōu)良菌種，但是有益突變頻率較低，變異的方向和性質(zhì)難以控制。

1.3 基因工程技術(shù)

王靖等發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌AC2005的核酸修復(fù)酶uvrA的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)隨著菌體所處醋酸濃度的增大而增加，于是構(gòu)建了uvrA基因敲除菌株和uvrA重組表達(dá)菌株，將菌株放置于一定的醋酸濃度下培養(yǎng)，比較它們的生長情況，uvrA重組表達(dá)菌株的生長量遠(yuǎn)高于原始菌株和uvrA基因敲除菌株，即使在較高酸度下，uvrA重組表達(dá)菌株的存活率也高于uvrA基因敲除菌株，在相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，uvrA重組表達(dá)菌株的產(chǎn)酸量比原始菌株高，而uvrA基因敲除菌株的產(chǎn)酸量比原始菌株低[13]，說明uvrA基因表達(dá)量的提高有利于醋酸菌的生長和產(chǎn)酸量的提高。脫氧核糖核酸(DNA)是細(xì)胞中重要的物質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞處于高酸高溫等不利條件下時(shí)，DNA會(huì)損傷，核酸修復(fù)酶可以使DNA恢復(fù)結(jié)構(gòu)的完整性，所以u(píng)vrA的過表達(dá)可能有利于醋酸菌在高酸度環(huán)境下進(jìn)行正常的生理代謝活動(dòng)。

宋山等通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增乙醇脫氫酶基因片段，構(gòu)建了乙醇脫氫酶過表達(dá)的基因工程菌株，該菌株的乙醇耐受性和平均產(chǎn)酸速率都優(yōu)于原始菌株[14]。乙醇脫氫酶是醋酸菌細(xì)胞膜上氧化乙醇生產(chǎn)醋酸的關(guān)鍵酶[15]，該酶的過量表達(dá)會(huì)提高乙醇的轉(zhuǎn)化率，防止胞外的乙醇流入胞內(nèi)使醋酸菌死亡。

徐澤明將編碼磷酸組氨醇氨基轉(zhuǎn)移酶的hisl基因成功導(dǎo)入巴氏醋桿菌中，構(gòu)建了耐乙醇的基因工程菌株T1，該菌株在9%乙醇濃度的條件下發(fā)酵產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量幾乎達(dá)到原始菌株的3倍[16]，將hisl基因過表達(dá)的菌株與親本菌株進(jìn)行發(fā)酵性能比較，發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的酶活均會(huì)影響到產(chǎn)酸量，酶活越高，產(chǎn)酸量越大，且在乙醇脅迫下醋酸菌的糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)途徑會(huì)受到抑制，與碳代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝相關(guān)的小分子代謝物含量會(huì)發(fā)生變化。

2 醋酸菌的耐酸機(jī)制

2.1 細(xì)胞膜的保護(hù)機(jī)制

Acetobacter和Komagataeibacter都是工業(yè)上常用的直接氧化乙醇產(chǎn)醋酸的醋酸菌屬，但是Komagataeibacter的最高產(chǎn)酸量比Acetobacter要高。Goto等通過比較細(xì)胞膜磷脂的化學(xué)組分發(fā)現(xiàn)，Komagataeibacter的磷脂酰膽堿含量明顯高于Acetobacter[17]。在Komagataeibacter的菌種發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，Higashide等發(fā)現(xiàn)隨著醋酸濃度的增加，細(xì)胞膜脂質(zhì)中磷脂酰膽堿的比例增加，磷脂酰甘油的比例減少[18]。Hanada等發(fā)現(xiàn)磷脂酰乙醇胺氮甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphatidylethanolamine N-methytransferase，PMT)基因可以使磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿，與正常表達(dá)pmt基因的菌株相比，pmt基因中斷突變株無法在細(xì)胞膜中產(chǎn)生磷脂酰膽堿，突變株的菌體生長速率變小，最大菌體密度下降[19]。因此，細(xì)胞膜中的磷脂酰膽堿含量被認(rèn)為與醋酸菌的耐酸性有關(guān)。

亓正良通過酸激復(fù)合紫外誘變篩選得到1株高產(chǎn)酸高耐酸的突變菌株A.pasteurianusCICIM B7003-02，該突變株在醋酸發(fā)酵過程中，細(xì)胞莢膜的分泌減少，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的比例增加，細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加[20]。因此，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和組成會(huì)影響醋酸菌的耐酸性。

2.2 醋酸同化機(jī)制

Fukaya通過對(duì)突變株A.pasteurianus進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)aarA和aarC是醋酸耐受性基因，與三羧酸循環(huán)中的酶的編碼有關(guān)，aarA編碼檸檬酸合成酶[21]；aarC編碼琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶和乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶，使琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為琥珀酸，使胞內(nèi)醋酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)[22]。Nakano發(fā)現(xiàn)順烏頭酸酶過表達(dá)菌株的產(chǎn)酸量與耐酸性都優(yōu)于原始菌株[23]，順烏頭酸酶是在三羧酸循環(huán)中轉(zhuǎn)化檸檬酸為異檸檬酸的酶。三羧酸循環(huán)偶聯(lián)有氧呼吸產(chǎn)能途徑——巴氏醋酸桿菌TCA循環(huán)其琥珀酰輔酶A到琥珀酸和蘋果酸到草酰乙酸的代謝通路的酶不存在，要通過其他氨基酸回補(bǔ)途徑運(yùn)行并釋放能量。胞內(nèi)醋酸可以通過三羧酸循環(huán)途徑被消耗，構(gòu)建胞內(nèi)完整且高效的三羧酸循環(huán)通路，會(huì)提高醋酸菌的耐酸性能。

2.3 醋酸泵出機(jī)制

AatA是細(xì)胞膜上的ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，可以將細(xì)胞內(nèi)的醋酸泵出[24]。Nakano等發(fā)現(xiàn)AatA基因中斷菌株在較高醋酸濃度的環(huán)境中，菌體生長速率下降，對(duì)醋酸的耐受性降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶AatA的大腸桿菌轉(zhuǎn)基因菌株對(duì)醋酸的耐受性得到了提高[25]。因此，AatA基因與醋酸菌的耐受性有關(guān)。

Matsushita發(fā)現(xiàn)醋酸菌A.pasteurianus胞內(nèi)的醋酸濃度在呼吸底物存在的情況下較低，添加呼吸作用解偶聯(lián)劑后，胞內(nèi)醋酸濃度增加，外側(cè)的膜囊泡通過呼吸作用產(chǎn)生的能量將被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入胞內(nèi)的醋酸泵出細(xì)胞外，內(nèi)側(cè)的膜囊泡通過呼吸作用積累醋酸，最終發(fā)現(xiàn)醋酸菌A.pasteurianus細(xì)胞膜上存在依靠質(zhì)子動(dòng)能勢的醋酸外排泵[26]。

2.4 細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)機(jī)制

Okamoto-Kainuma發(fā)現(xiàn)當(dāng)醋酸菌處在含有乙醇、醋酸、高溫的環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多種分子伴侶蛋白[27]。其中，GroES和GroEL含有熱休克啟動(dòng)子同源序列，這2種蛋白質(zhì)的表達(dá)受到RpoH基因的控制，實(shí)驗(yàn)表明，RpoH基因中斷突變菌株對(duì)乙醇、醋酸、溫度變化的耐受性比原始菌株差，而過量表達(dá)GroES的菌株的產(chǎn)酸量比原始菌株高[28]。

醋酸菌在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的酶的催化作用下，將乙醇氧化為乙醛再氧化為醋酸。乙醇脫氫酶(ADH)將乙醇氧化為乙醛，乙醛脫氫酶(ALDH)將乙醛氧化為醋酸，電子從乙醇和乙醛轉(zhuǎn)移到輔酶Q，生成泛素醇[29,30]，最終泛素醇氧化酶將電子從泛素醇轉(zhuǎn)移到氧中生成水[31]。當(dāng)不能反應(yīng)完全時(shí)，會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，如超氧陰離子和過氧化氫，Okamoto-Kainuma發(fā)現(xiàn)，在含有乙醇和醋酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)醋酸菌，過氧化氫酶調(diào)節(jié)因子突變株不能調(diào)節(jié)胞內(nèi)過氧化氫濃度，其生長速率比原始菌株慢[32]。這些現(xiàn)象表明醋酸菌細(xì)胞內(nèi)活性氧的快速降解有利于實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的醋酸發(fā)酵。

3 結(jié)論與展望

高產(chǎn)酸醋酸菌的選育方法包括自然育種、誘變育種和基因工程技術(shù)。選育出高產(chǎn)酸的菌種，提高菌體的比生長速率，可以使單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)酸量提高，對(duì)高酸度液態(tài)醋的工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。其中，通過基因工程技術(shù)改良菌種的方法更具有針對(duì)性，應(yīng)該作為高產(chǎn)酸菌種選育的研究重點(diǎn)。

醋酸菌的耐酸機(jī)制十分復(fù)雜，目前對(duì)醋酸菌耐酸機(jī)制的認(rèn)識(shí)并不透徹。已發(fā)現(xiàn)的醋酸菌耐酸機(jī)制，包括細(xì)胞膜的保護(hù)機(jī)制、醋酸同化機(jī)制、醋酸泵出機(jī)制、細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)機(jī)制4個(gè)方面。尋找這些機(jī)制的聯(lián)系和紐帶，研究這些機(jī)制之間的協(xié)作關(guān)系，探索新的耐酸機(jī)制，對(duì)全面地闡明醋酸菌的耐酸機(jī)制具有重要的意義，有利于指導(dǎo)高產(chǎn)酸菌種的選育，為高酸度醋生產(chǎn)的菌種選育方面提供了幫助。