孫莉，胡文康，付彬，沈婉瑩，徐寧

(湖北工業(yè)大學(xué) 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068)

米曲霉(Aspergillusoryzae)屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、從梗孢科、曲霉屬，它的應(yīng)用歷史悠久，早在我國(guó)周朝就開始用其釀造豆醬，隨后傳入日本、朝鮮等亞洲國(guó)家，當(dāng)今也是亞洲發(fā)酵食品生產(chǎn)中使用的主要釀造真菌[1]。真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量的次生代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物往往是具有有效的生理活性的低分子量物質(zhì)，通過(guò)分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的研究，表明真菌次生代謝產(chǎn)物是由成簇的基因編碼的[2]。米曲霉基因組已被破譯，比同屬中重要的病原菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和工業(yè)發(fā)酵菌黑曲霉(Aspergillusnidulans)大25%～30%，因此米曲霉可能產(chǎn)生更豐富的次生代謝產(chǎn)物[3]。食品安全問(wèn)題已經(jīng)是一個(gè)全世界都關(guān)注的問(wèn)題，其中真菌毒素引起的食品安全問(wèn)題日益嚴(yán)重，這些毒素就來(lái)源于真菌代謝產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物。雖然米曲霉是目前世界上公認(rèn)的安全食用菌種，但是隨著對(duì)米曲霉次生代謝產(chǎn)物的深入研究，發(fā)現(xiàn)其中存在少量種類的真菌毒素，存在潛在的食品安全危害，可能對(duì)人體健康造成危害[4]。本文綜述了米曲霉次生代謝產(chǎn)物真菌毒素的研究進(jìn)展，有助于避免米曲霉真菌毒素可能引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

1 環(huán)匹阿尼酸

環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)是一種吲哚-六氫茚-吡咯烷類神經(jīng)毒素(indole-hydrindane-tetramic acid neurotoxin)，分子式為C20H20N2O3，是曲霉屬次生代謝產(chǎn)生的真菌毒素之一[5]。CPA是由Holzapfel C W首次在青霉菌中分離得到的，并在1977年證實(shí)CPA存在于米曲霉中[6]。Yokota T等第一次從米曲霉中分離出CPA，并用蠶來(lái)證實(shí)其可以引發(fā)病變[7]。而后研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)食品釀造中使用的米曲霉并未代謝產(chǎn)生CPA，只在一些野生型米曲霉中有發(fā)現(xiàn)[8]。Hill J E等又利用小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CPA的毒性作用[9]。CPA的毒性機(jī)理已研究得較為清晰，其毒性與黃曲霉素相當(dāng)，主要是抑制了Ca2+-ATP酶，從而阻斷Ca2+的轉(zhuǎn)移，使得心肌收縮力減弱[10]。

米曲霉在固態(tài)培養(yǎng)和液態(tài)培養(yǎng)中均可生成CPA，但CPA的毒性往往因?yàn)榕c它同時(shí)存在的黃曲霉毒素而被人們忽視[11]。薄層色譜法是目前在真菌培養(yǎng)以及農(nóng)產(chǎn)品中應(yīng)用最普遍的CPA測(cè)定方法[12]。趙刪等[13]利用高效液相色譜法測(cè)定米曲霉中CPA的含量，所建立的方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。Rodríguez A等研究出了實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)方法，對(duì)參與CPA生物合成的酶：二甲基烯丙基色氨酸合成酶設(shè)計(jì)特異性引物(dmaTF/dmaTR)，利用TaqMan探針(dmaTp)對(duì)dmaT編碼基因進(jìn)行雜交，在不同的人工接種食物中評(píng)估qPCR方案量化CPA產(chǎn)生霉菌的能力，這種方法可以用來(lái)在HACCP監(jiān)管體系中防止整個(gè)食物鏈中CPA產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)[14]。以上方法為米曲霉真菌毒素CPA安全檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

2 3-硝基丙酸

3-硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NPA)是一種由多種霉菌產(chǎn)生的具有神經(jīng)毒性的真菌毒素[15]，分子式為C9H9NO4。第一次在米曲霉中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)是由Nakamura S團(tuán)隊(duì)完成的[16]，隨后Matsumoto H等對(duì)3-NPA結(jié)構(gòu)的光譜學(xué)特征進(jìn)行了分析和報(bào)道[17]。3-NPA是一種琥珀酸脫氫酶(SDH)抑制劑，它會(huì)在紋狀體中產(chǎn)生行為、生化和組織學(xué)變化，在動(dòng)物和人類中引發(fā)亨廷頓病[18]。它產(chǎn)生的紋狀損傷是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒的表現(xiàn)，有多種生理反應(yīng)例如嘔吐、眩暈、抽搐等，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致死亡。還有相關(guān)報(bào)道指出3-NPA可能發(fā)生中毒，從而導(dǎo)致兒童延遲性肌張力障礙[19]。研究發(fā)現(xiàn)它會(huì)引起小鼠模仿年老老鼠的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)的缺陷。Haine S， Kari M比較了生理鹽水和3-NPA(劑量為420 mg/kg)對(duì)小鼠的影響，使用迷宮和小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)(rotarod test)測(cè)試了運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性，結(jié)果顯示注射3-NPA比注射生理鹽水出現(xiàn)錯(cuò)誤多很多[20]。研究還發(fā)現(xiàn)每4天向6～10周大的小鼠腹腔內(nèi)注射劑量為10 mg/kg的3-NPA，連續(xù)28天便可以引起小鼠神經(jīng)變性[21]。George A等對(duì)3-NPA進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，認(rèn)為成人3-NPA的安全攝入量應(yīng)不超過(guò)25 μg/kg·天[22]。3-NPA在米曲霉的固態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)中均可以產(chǎn)生，但其毒性比CAP要弱。3-NPA檢測(cè)方法已經(jīng)開發(fā)許多種，如Shao G J等開發(fā)利用固相萃取-離子色譜法測(cè)定甘蔗中的3-NPA；胡文娟等利用薄層色譜法檢測(cè)了甘蔗中3-NPA的含量；劉勇等[23]用液相色譜法和氣相色譜法檢測(cè)了動(dòng)物血漿中的3-NPA含量；江濤等用液相色譜檢測(cè)方法測(cè)定了米曲霉菌培養(yǎng)物中3-NPA的含量[24]。

近年來(lái)，人們致力于抑制3-NPA毒性的研究，Jang M等研究發(fā)現(xiàn)1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥榭赡軙?huì)預(yù)防和改善3-NPA 誘導(dǎo)小鼠模型中亨廷頓病的神經(jīng)損傷和紋狀細(xì)胞死亡[25]。Colle D等研究發(fā)現(xiàn)丁二醇可以通過(guò)負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控來(lái)預(yù)防3-NPA誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激(一種血管病變的重要病理過(guò)程)[26]。Calderón G D研究驗(yàn)證了腦活素在治療3-NPA中毒的鼠腦中保護(hù)大腦免受自由基影響的假設(shè)[27]。 因此，人們對(duì)3-NPA的防治越來(lái)越完善。

3 麥芽米曲霉素

麥芽米曲霉素(maltoryzine) 是一種曲霉屬真菌毒素，分子式為C11H12O4，最早是由Iizuka H等從米曲霉發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)，并發(fā)現(xiàn)它對(duì)小鼠有肌麻痹作用，腹膜下給藥IC50為3 mg/kg[28]。麥芽米曲霉素可能會(huì)對(duì)腦中樞神經(jīng)具有損害，并有麻痹、飲食不進(jìn)的風(fēng)險(xiǎn)，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其具有致癌或基因致癌的作用。

Abdelghany T M等利用HPLC技術(shù)對(duì)黑曲霉中的麥芽米曲霉素進(jìn)行純化和測(cè)定，具體方法是將黑曲霉分別接種在含有2%小麥粒的天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基(Czapek Dox)于250 mL錐形瓶中，每個(gè)瓶中含有40 mL調(diào)節(jié)至pH 6.5的培養(yǎng)基，并在(28±2) ℃下培養(yǎng)10天。再將分離出的培養(yǎng)物單獨(dú)混合，然后在真空下過(guò)濾除去生物質(zhì)，用正丁醇萃取，并將有機(jī)溶劑在真空下蒸發(fā)至干燥，得到粗提取物。將5 g粗提取物溶于CH3OH(HPLC級(jí))中。通過(guò)HPLC分離提取器，C18色譜柱(200 mm×4.6 mm×5 μm)進(jìn)行檢測(cè)，流速為1 mL/min，流動(dòng)相為80%甲醇水溶液。通過(guò)UV檢測(cè)器在波長(zhǎng)215 nm處進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)具有不同濃度的二甲雙胍A和C的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定[29]。

此方法為米曲霉中的麥芽米曲霉素的檢測(cè)提供了借鑒方法，方便人們更加深入地研究米曲霉在不同培養(yǎng)條件下的毒素產(chǎn)生情況。

4 曲酸

曲酸是(kojic acid)是米曲霉的主要次生代謝物之一，分子式為C6HO4，它廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品中。曲酸首先被報(bào)道為一種來(lái)自于蒸米上的米曲霉的結(jié)晶物質(zhì)[30]。 Burdock G A等發(fā)現(xiàn)用谷物固態(tài)發(fā)酵的方法可以使曲酸高產(chǎn)，同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)曲酸的結(jié)構(gòu)與己糖有著類似的相對(duì)簡(jiǎn)單的代謝途徑。目前尚未報(bào)道由口服劑量引起的急性或亞慢性毒性，但如果注射曲酸，則可能發(fā)生驚厥[31]。由于它可以對(duì)酪氨酸酶的活性有一定抑制作用[32]，學(xué)術(shù)界對(duì)曲酸的安全性頗有爭(zhēng)議。在化妝品領(lǐng)域，曲酸因?yàn)橛锌购谏匦纬傻淖饔枚鳛槊腊讋33]。但Nakagawa M等對(duì)220位懷疑因使用化妝品而患有皮炎的女性患者進(jìn)行了斑貼試驗(yàn)，其中8名使用含至少1種曲酸產(chǎn)品的患者中在開始使用含曲酸的產(chǎn)品后1～12個(gè)月出現(xiàn)面部皮炎[34]，從而進(jìn)一步證明曲酸可能會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生不良反應(yīng)。Zhang X還發(fā)現(xiàn)曲酸在一定程度上減少了葉綠素的損失以及水的蒸發(fā)，可作為一種保鮮劑。Wang 等還發(fā)現(xiàn)曲酸可以保護(hù)小鼠免受伽馬射線輻射的傷害，他們對(duì)30天生存率雄鼠的外周血參數(shù)進(jìn)行變化評(píng)估測(cè)試，注射300 mg/kg體重的曲酸的實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的老鼠在一次致命劑量的照射下，注射曲酸的組所需致命劑量更高[35]。

曲酸的測(cè)定方法有很多種，Piantavini M S等利用紫外分光光度法來(lái)測(cè)定曲酸含量， Jiang Q等用高效液相色譜(HPLC)方法，利用電化學(xué)檢測(cè)器來(lái)測(cè)定食品或化妝品中曲酸的含量[36]，Lin Y H 等還利用毛細(xì)管電泳法對(duì)化妝品中的曲酸進(jìn)行分析。此外，還有銅沉淀法、氯化鐵比色測(cè)定法等。

曲酸在病例毒性上尚未明確，但根據(jù)其會(huì)對(duì)皮膚造成損害的特點(diǎn)將其暫時(shí)歸為真菌毒素類，因其存在損害皮膚以及美白等影響，深入研究曲酸仍然具有重要意義。

5 結(jié)論與展望

米曲霉在我國(guó)以及整個(gè)亞洲地區(qū)的發(fā)酵食品中都有著非常廣泛的應(yīng)用，其次生代謝產(chǎn)物真菌毒素的安全性更是得到人們的密切關(guān)注，本文對(duì)4種主要米曲霉真菌毒素的起源、病理毒性、檢測(cè)方法與防治進(jìn)行了綜述，為米曲霉在發(fā)酵食品工業(yè)和生物工程產(chǎn)酶載體等領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供了參考思路。現(xiàn)階段對(duì)米曲霉產(chǎn)真菌毒素的條件和代謝機(jī)制尚未清晰，還需要深入的研究，指導(dǎo)食品用米曲霉的選育、發(fā)酵代謝調(diào)控和安全評(píng)估，以消除潛在真菌毒素的危害。