摘 要：通過從對大青楊（Poplus ussuriensis）無性系葉芽用秋水仙堿誘導(dǎo)處理獲得的變異株進(jìn)行的形態(tài)特征及染色體鑒定，證實(shí)所獲得的4個變異株均為多倍體，這些變異株在形態(tài)特征方面具有巨大性，苗期在高生長和地徑生長均表現(xiàn)突出，染色體鑒定證實(shí)其多倍性，具有巨大潛在的商業(yè)和生產(chǎn)應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：大青楊;多倍體誘導(dǎo);葉面積;氣孔;染色體檢測

一、材料與方法

1.試驗材料

供試材料來源于經(jīng)選優(yōu)后已消除年齡及位置效應(yīng)的12個大青楊無性系穗條。

2.試驗方法

（1）藥物處理方法。將穗條按無性系編號扦插于齊齊哈爾市愛華林場溫室中，每個無性系分為5組，每組50個穗條，做好標(biāo)記。待葉芽破芽苞展開后，用棉球蘸事先已配制好的秋水仙堿液（其濃度分別為0.0%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%），按順序放于參試的無性系葉芽上，每天在棉球上滴藥3次，處理時間維持6d。

隨時觀察被處理的葉芽的反應(yīng)及生長情況，并注意剔除未被處理或處理后葉芽死亡的穗條，在秋后，剪取枝條，保存，翌年按編號剪成穗條，扦插，觀察各系號形態(tài)，選擇形態(tài)巨大者，與未處理無性系在秋季苗木停止生長后，進(jìn)行葉面積和氣孔輔助鑒定，對變異株在秋后取穗條與未處理無性系穗條經(jīng)水培發(fā)根，取根作染色體鑒定。

（2）葉面積和氣孔輔助鑒定方法

①葉面積輔助鑒定方法：取供試苗木上，分上、中、下三個部位各取三片葉子，采用坐標(biāo)方格量測葉面積。

②氣孔輔助鑒定方法：取供試苗木葉片，撕取葉背面的下表皮，放載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察，同時用測微尺對氣孔的長、寬進(jìn)行測量統(tǒng)計分析。

（3）染色體鑒定方法

①切取根尖，于200C浸入0.2%秋水仙堿液中，處理5h（最佳處理時間10-15：30）。

②固定：用卡諾固定液（甲醇：醋酸3：1）固定0.5h以上。

③酸解：用1NHCL在600C恒溫水浴中準(zhǔn)確處理14min。

④醋酸地衣紅染色：用蒸溜水洗去HCL，放在載玻片上，滴一滴醋酸地衣紅染液，直到莖尖染為深紅色為適，用蓋玻片壓片。

⑤鏡檢、計數(shù)、拍照：選取染色體分散良好的細(xì)胞拍照，計數(shù)。

二、結(jié)果

通過近4a的誘導(dǎo)、選擇，從近6000個處理穗條中，從形態(tài)外觀上符合育種目標(biāo)的單株僅4株，分別對它們進(jìn)行了編號及進(jìn)行了葉面積及氣孔輔助鑒定和染色體鑒定，證實(shí)其確為加倍植株，其形態(tài)特征描述如下：

1號變異株：葉大、前鈍，正面淺綠色，莖條節(jié)間長，葉片在莖上微下垂。

2號變異株：葉大、長橢園形，前鈍尖，正面深綠色，莖條節(jié)間短促，葉片下垂，覆蓋莖條。

3號變異株：葉大、厚、前鈍，正面深綠色，莖條粗壯、節(jié)間短促，葉片與莖成直角。

4號變異株：葉大、厚、有皺折、葉脈突出，正面深綠色，莖條節(jié)間長，葉片在莖上微下垂。

三、討論

1.關(guān)于誘導(dǎo)率低的原因探討

研究發(fā)現(xiàn)，大青楊葉芽的油脂較其它楊樹葉芽多得多，油脂呈黃色，對葉芽起保護(hù)作用，它給水溶性藥物處理帶來很大困難。1999年春，處理的葉芽是葉芽剛剛萌動，秋后調(diào)查，均未發(fā)現(xiàn)有變異株出現(xiàn)。我們改進(jìn)處理方法，既處理時間改在葉芽破苞后，芽已完全開放時，處理起了作用，秋季調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有4個變異株。統(tǒng)計分析，誘導(dǎo)變異率非常低。針對油脂問題，我們也曾采取用乙醚去脂后，再進(jìn)行藥物處理的方法，但由于多次處理對芽傷害太大，造成葉芽生長畸形或死亡，未獲得滿意的變異株。

2.藥物處理濃度的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的秋水仙堿對大青楊葉芽的誘導(dǎo)效率明顯不同，0.1%濃度的秋水仙堿，處理后葉芽均無反應(yīng)，0.2%濃度的秋水仙堿，處理后，有部分葉芽變黑，后死亡（占48%），并產(chǎn)生部分變異株（占0.3～0.5%），0.5%濃度的秋水仙堿，處理后，大部分分芽發(fā)黑，后死亡，一部分未變黑，后葉死亡，1.0%濃度的秋水仙堿，處理后，芽幾乎全部變黑死亡。從整個實(shí)驗看，以0.2%濃度的秋水仙堿液對大青楊葉芽處理最為有效。

研究證明，這一系列濃度的秋水仙堿應(yīng)當(dāng)不至于造成芽的死亡，因而造成芽死亡的主要原因是，由于藥物處理是在圃地和溫室，棉球水份蒸發(fā)很快，同時還每天繼續(xù)滴加秋水仙堿液，它會造成秋水仙堿濃度急劇上升，對葉芽的毒害作用不斷加強(qiáng);另一方面是由于陽光的作用，秋水仙堿不斷分解，毒素積累，會對葉芽產(chǎn)生毒害作用。毒害作用的累加，是造成葉芽死亡的主要原因。

3.變異株的輔助鑒定

研究證實(shí)，多倍體在形態(tài)特征方面具有巨大性，如葉片面積大、葉片厚及氣孔大等，因此，完全可以利用植株的上述形態(tài)特征，間接地對多倍體植株的倍性進(jìn)行輔助鑒定。

（1）葉面積的統(tǒng)計分析。變異株葉片正面呈黑綠色，大而厚。變異株與對照在苗高、地徑、葉面積大小上差異均十分顯著，其中變異株-1表現(xiàn)的最為突出。

（2）氣孔長、寬的比較分析。從苗木相同部位葉子下表皮氣孔的長、寬進(jìn)行顯微測量的結(jié)果顯示，變異株的氣孔均比對照大，且差異顯著。

4.變異株的染色體鑒定

從根尖制作的染色體片中，各觀察了30個細(xì)胞，確定了它們的染色體數(shù)目。鑒定結(jié)果表明，大青楊體細(xì)胞染色體數(shù)目2n=38。誘導(dǎo)的變異株體細(xì)胞染色體比較復(fù)雜，為具有各種染色體數(shù)量的混倍體，這與Casen在1970年用低濃度秋水仙堿液處理楊樹枝產(chǎn)生的是混倍體結(jié)論相同，比較鑒定結(jié)果認(rèn)定誘導(dǎo)的4個變異株，1、2、3號為四倍體，4號為八倍體。

四、結(jié)語

在經(jīng)秋水仙堿誘導(dǎo)大青楊染色體加倍群體中，共選擇出四個變異株，與對照相比在形態(tài)特征方面差異顯著，這些變異株在形態(tài)特征方面具有巨大性，苗期在高生長和地徑生長均表現(xiàn)十分突出，特別它是由選擇出的優(yōu)良個體進(jìn)一步加倍獲得，其遺傳增益是在優(yōu)良個體遺傳基礎(chǔ)上的，可直接用于營林生產(chǎn)，同時，這些變異株具有潛在的巨大商業(yè)價值和生產(chǎn)應(yīng)用價值。

作者簡介：戚匹儒（1973-）男，黑龍江克東籍，大學(xué)學(xué)歷，高級工程師，主要從事林業(yè)規(guī)劃設(shè)計、工程造林、林業(yè)工程管理與技術(shù)指導(dǎo)工作。