◎ 額日赫木，鄧慧清，楊亞萍，張 琪，宋小青

（山西師范大學食品科學學院農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏實驗室，山西 臨汾 041004）

黍子是中國北方干旱或半干旱地區(qū)的主要糧食作物之一，也是中國獨具特色的雜糧作物之一[1-3]。我國是世界上黍子栽培面積最大的國家，種植面積約為10 000 km2，在北方（西北、華北、東北等）山區(qū)均有種植，資源豐富[4]。黍子果實為穎果，脫皮后可食用，其富含蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、維生素和礦物質(zhì)，近年來的一些研究表明，黍子中含有豐富的具有降血糖、降血脂、抗氧化等功能的天然活性物質(zhì)，如酚類物質(zhì)、植酸、生物堿等[5]。隨著人們對黍子的認可度的提高和食品精加工技術(shù)的提高，黍子加工產(chǎn)業(yè)也得到了較好的發(fā)展。然而，加工過程中產(chǎn)生的谷殼部分除了用于飼料生產(chǎn)外，多處于廢棄狀態(tài)，這不僅浪費了資源，而且會造成環(huán)境的污染[6]。黍子谷殼占其果實總質(zhì)量的20%左右[7]，其中含有豐富的纖維素、半纖維素等成分，具有較高的利用價值[8]。因此，提高黍子谷殼的綜合利用率，將對我國雜糧產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有積極推動作用。

超聲波是頻率范圍為1.6×104～1.6×109Hz的聲波，屬于機械波的一種。它作為一種物理能量形式和輔助加工方法，被廣泛應用于提取、乳化、殺菌、檢測、加工等食品工業(yè)及食品酶類的研究中均得到了廣泛的應用[9-10]。空化效應、熱效應和機械作用是超聲波技術(shù)應用的理論依據(jù)。其中，空化效應被認為是最重要的理論依據(jù)，其可以導致充氣氣泡的產(chǎn)生及微射流的出現(xiàn)[11]。一些研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理可以改變酶類分子空間構(gòu)象，使其活性隨之發(fā)生改變。它通過對介質(zhì)的空化作用，機械作用和超聲混合效應使分子之間的相互作用力（氫鍵、疏水相互作用、范德華力等）發(fā)生改變，使更多的反應中心形成與暴露，有利于不同分子間的相互作用[12-15]。基于此，本研究試圖利用超聲波技術(shù)提高半纖維素酶和纖維素酶的活性，繼而提高其對黍子谷殼的酶解效率。首先篩選出半纖維素酶和纖維素酶的最佳酶解條件；然后考察超聲波預處理半纖維素酶和纖維素酶對酶解黍子谷殼的能力。將黍子谷殼中的半纖維素和纖維素盡可能轉(zhuǎn)化為可被利用的分子量小的糖分子，為黍子谷殼中生物活性多糖的提取利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品的制備

黍子（晉黍8號）谷殼購自山西省山陰縣，將黍子谷殼用流水反復沖洗數(shù)次（除去淀粉等物質(zhì)）。經(jīng)蒸餾水再次進行洗凈3次，得到殘渣，再將殘渣置于鼓風干燥箱中烘干（75 ℃，15 h）至恒重。將干物質(zhì)樣品粉碎，過篩（100目），后再次干燥至恒重，裝入密封袋后置于干燥器中備用。

1.1.2 試劑

分析純（氫氧化鈉、丙三醇、冰乙酸、無水乙酸鈉、葡萄糖）南京化學試劑股份有限公司；3-5二硝基水楊酸（化學純）上海弘順生物科技有限公司；纖維素酶（食品級，活性2 000 U·g-1）、半纖維素酶（食品級，活性2 000 U·g-1）上海寶豐生化有限公司。

1.1.3 儀器

DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、DZKW-D-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、FS-1200N超聲波處理器（上海生析超聲波有限公司）、pH-25數(shù)顯pH計（上海儀電科學儀器有限公司）、752型紫外分光可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

（1）黍子谷殼溶液的配制。準確稱取1.01 g的上述干燥黍子谷殼樣品，移入100 mL的燒杯中，加入50 mL緩沖溶液進行攪拌溶解，再將其移入到100 mL容量瓶中定容到刻度，得到1%的樣品溶液備用。

（2）酶溶液的配制。分別稱取100 mg的纖維素酶和半纖維素酶，移入100 mL的燒杯中，加入25 mL緩沖溶液進行攪拌溶解，再將其移入100 mL容量瓶中定容到刻度，得到0.1%的酶溶液4 ℃條件下冷藏備用。

（3）乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的配制。量取11.55 mL冰乙酸定容至1 000 mL容量瓶中，即得到0.2 moL·L-1的乙酸溶液；稱取16.4 g無水乙酸鈉溶于蒸餾水后定容至1 000 mL容量瓶中，即得0.2 moL·L-1的乙酸鈉溶液。由此分別配制不同pH值的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。

（4）DNS試劑的配制。參照鞏莉等[16]的研究并加以改動。準確稱取3.25 g的3,5-二硝基水楊酸用蒸餾水充分溶解待用。稱取20 g氫氧化鈉用蒸餾水充分溶解，冷卻后移入250 mL容量瓶（2 moL·L-1），定容備用。將上述水楊酸溶液移入500 mL容量瓶，并加入162.5 mL的氫氧化鈉溶液，再加入7.5 mL丙三醇溶液充分溶解后定容至500 mL，移入棕色試劑瓶中4 ℃貯存待用。

1.2.2 實驗設計

1.2.2.1 酶解條件的篩選

確定半纖維素酶和纖維素酶的最佳pH值、水浴溫度、水浴時間等酶解條件，實驗設計見表1。

表1 酶解條件的設計表（n=5）

1.2.2.2 超聲波預處理條件的篩選

將150 mL 0.1%的半纖維素酶或纖維素酶溶液移入200 mL燒杯中，置于超聲處理裝置內(nèi)（見圖1），使變幅桿探頭置于1 cm酶溶液深度，儀器固定頻率為20 kHz，變幅桿直徑為20 mm。對半纖維素酶和纖維素酶進行超聲波處理，設定超聲處理條件：①固定超聲時間為25 min，超聲功率分別設為0、120、240、360、480 W和600 W。②固定超聲功率為360 W，超聲時間分別設為 0、2、4、6、8 min和10 min。從而考察超聲功率和時間對半纖維素酶或纖維素酶活性的影響。

圖1 超聲處理系統(tǒng)示意圖

1.2.2.3 半纖維素酶和纖維素酶活性在不同貯存時間內(nèi)的變化

在相同的超聲處理條件下，分別對纖維素酶和半纖維素酶進行超聲處理，考察兩種酶在不同放置時間，即0、2.5、5、7.5、10、12.5 h和15 h時的酶活性變化。

1.2.2.4 葡萄糖標準曲線的制作

準確稱取0.5 g葡萄糖，充分溶后定容至500 mL容量瓶中（1 mg·mL-1)備用，標準曲線是參照趙凱等[17]的研究并加以改動，繪制出的吸光值-葡萄糖濃度曲線，見圖2。

以葡萄糖的吸光值為y軸，以其濃度為x軸，進行線性回歸，并求得線性回歸方程為y=0.81x-0.0117，R2=0.996 6。

圖2 葡萄糖標準曲線圖

1.2.2.5 酶活性的測定

參照謝現(xiàn)英[18]的研究并適當加以改動來測定半纖維素酶和纖維素酶活性；通過測定分解黍子谷殼產(chǎn)生的還原糖（葡萄糖計）含量，再將其換算為酶活性。將1 mL的1%的黍子谷殼殘渣溶液移入10 mL刻度試管中，加入0.5 mL、0.1%的酶溶液，置于水浴鍋中加熱反應，再加入1 mL的DNS試劑，置于沸水浴中加熱15 min滅酶。待冷卻至室溫后，定容至10 mL，在波長540 nm處測定其吸光值?？瞻讓φ占尤? mL、1%的黍子谷殼廢渣溶液，再加入0.5 mL蒸餾水，其他條件均不變。

1.2.3 統(tǒng)計學方法

各組循環(huán)處理5次，取平均值，采用Excel 2007進行統(tǒng)計分析，利用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以p＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的篩選

如圖3所示，當反應體系中酶解pH值為4～6，半纖維素酶酶解黍子谷殼殘渣所得的葡萄糖濃度值呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；當pH值為5.0時，濃度顯示最高值（0.39 mg·mL-1），且pH為5.5與5.0相比，并無顯著性差異（p＞0.05）。因此，半纖維素酶的最佳酶解pH為5.0～5.5。纖維素酶在酶解pH值為5.5和6.0時，其分解黍子谷殼殘渣所得的葡萄糖濃度顯示最高值（分別為0.279和0.280 mg·mL-1），而且兩者并無顯著性差異（p＞0.05）。提示環(huán)境pH值的變化會改變酶分子的結(jié)構(gòu)（官能團的變化）或空間構(gòu)象，pH值過大或過小將會導致酶活性升高或降低，從而使酶解率隨之發(fā)生改變[19]，因此選擇適當?shù)膒H環(huán)境對酶解反應尤為重要。故選取pH為5.0和5.5分別作為半纖維素酶和纖維素酶的酶解反應最佳pH值，在此條件下，酶與底物相互結(jié)合，并產(chǎn)生最高催化作用，有利于酶促反應的快速進行。

圖3 不同pH值對葡萄糖濃度的影響圖（n=5）

如圖4所示，隨著水浴時間的延長，兩種酶酶解黍子谷殼殘渣所得的葡萄糖濃度值都出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當水浴時間為15 min時，葡萄糖濃度達到最大值，即半纖維素為0.358 mg·mL-1、纖維素酶為0.276 mg·mL-1。然而，這與水浴時間為25 min時相比，并無顯著性差異（p＞0.05）。當反應時間大于25 min時，其葡萄糖濃度明顯降低，這可能由于加熱時間過長而可能導致兩種酶的分子結(jié)構(gòu)（如氫鍵斷裂）發(fā)生改變，繼而使其活性隨之降低。故半纖維素酶和纖維素酶最佳水浴時間都為15～25 min。從節(jié)能的角度考慮，兩種酶的水浴時間可確定為15 min。

圖4 不同水浴時間對葡萄糖濃度的影響圖（n=5)

如圖5所示，當水浴溫度為50 ℃時，半纖維素酶酶解黍子谷殼殘渣所得的葡萄糖濃度顯示最大值（0.379 mg·mL-1）。但其與水浴溫度為40 ℃時相比較，兩者間并無顯著性差異（p＞0.05）。然而楊立霞[20]的研究表明，3種纖維素酶即木聚糖酶、甘露聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的最佳反應溫度均為50 ℃。裴建軍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，半纖維素酶系主要是由木聚糖誘導，而木聚糖酶的最適反應溫度為60 ℃。由此可見，不同種類的半纖維素酶，其最適反應溫度有所不同，當半纖維素酶處于混合時，其最適反應溫度與單一的酶相比可能發(fā)生不同程度的改變。故半纖維素酶最佳水浴溫度范圍可確定為40～50 ℃。在相同的水浴溫度范圍內(nèi)，纖維素酶酶解黍子谷殼殘渣所得的葡萄糖濃度，在60 ℃時顯示最大值（0.282 mg·mL-1）。但這與水浴溫度為40和50 ℃時相比，并無顯著性差異（p＞0.05）。相關(guān)研究如秦廣利等[22]表明，纖維素酶在酶解溫度為56 ℃的條件下，水解酒糟不溶性纖維素產(chǎn)生可溶性糖的含量最高。李妍等[23]研究表明，酶解溫度為55 ℃時，對纖維素酶的處理能夠改善粉葛糖化的效果。由此可見，纖維素酶的酶解溫度為40～60 ℃時，顯示較高的酶活性，并取決于酶解pH值、溫度等因素的變化。由于高溫水浴會消耗較多的能量，故選擇40 ℃作為半纖維素酶和纖維素酶的酶解溫度較為合理。

圖5 不同水浴溫度對葡萄糖濃度的影響圖（n=5)

綜上所述，當pH值為5.0、水浴溫度為40 ℃、水浴時間為15 min時，可作為半纖維素酶的最佳酶解條件。當pH值為5.5、水浴溫度為40 ℃、水浴時間為15 min時，可作為纖維素酶的最佳酶解條件。通過對兩種水解酶最佳酶解條件的確定，為超聲波處理的實施奠定了基礎(chǔ)。

2.2 超聲波預處理條件的篩選

如圖6所示，半纖維素酶在超聲功率為480 W時，其酶活性顯示最大值（528.27 mg·g-1·min-1），與未超聲處理相比，其酶活性提高了25%，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。然而，超聲功率為480～600 W時，其酶活性并無顯著性差異（p＞0.05）。纖維素酶在超聲功率為120 W時，其酶活性顯示最大值（528.27 mg·g-1·min-1），與未超聲處理相比，其酶活性提高了25%，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。覃益民等[24]的研究表明，β-果糖基轉(zhuǎn)移酶在20 kHz、300 W功率下超聲處理5 min，與未超聲處理相比其活性提高了12%。許可等[25]的研究表明，海芋過氧化酶在超聲功率為25 W、頻率為13.5 kHz、超聲時間為4 min時，這與原酶液相比，其酶活性降低了36.2%。說明不同的酶類在不同的超聲功率下，其酶活性產(chǎn)生的影響也不同。在適當?shù)奶幚項l件下，超聲波可能改變酶類分子結(jié)構(gòu)（如空間結(jié)構(gòu)）從而導致其活性發(fā)生改變。

圖6 超聲功率對半纖維素酶和纖維素酶活性的影響圖（n=5）

由圖7可知，當超聲處理時間為6 min時，半纖維素酶活性達到最大值，即495.71 mg·g-1·min-1，與未處理相比，其活性顯著提高了14.73%，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。然而在2～8 min，半纖維素酶活性并無顯著性差異（p＞0.05）。在同樣條件下，纖維素酶在超聲處理6 min時達到最高活性，即309.64 mg·g-1·min-1，與未處理相比較，其活性顯著提高了14.27%，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。然而半纖維素酶活性在2 min和4 min時，差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。黃六容等[26]的研究表明，木瓜蛋白酶在超聲功率為40 W，超聲處理時間為5 min時，木瓜蛋白酶活性達到最高值，其與未超聲處理相比其活性提高了9%，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。而石文奇等[27]的研究表明，當超聲功率為80 W，超聲處理時間為4 min時，α-淀粉酶顯示最高活性。由此可知，在適當?shù)某曁幚頃r間內(nèi)可以提高水解酶類活性。因此，半纖維素酶和纖維素酶的最佳超聲時間為4～6 min。從節(jié)能角度考慮，應選用4 min。

圖7 超聲時間對半纖維素酶和纖維素酶活性的影響圖（n=5)

2.3 半纖維素酶和纖維素酶活性在不同貯存時間內(nèi)的變化

由圖8可知，超聲處理和未經(jīng)處理的半纖維素酶和纖維素酶，隨著放置時間的延長，其活性均不斷下降。放置時間在0～5 h內(nèi)，經(jīng)超聲處理的兩種酶均能保持較高的活性，半纖維素酶活性為491.69～502.48 mg·g-1·min-1，纖維素酶活性為 283.31 ～ 298.81 mg·g-1·min-1，且二者差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05)。這與未經(jīng)超聲處理的半纖維素酶和纖維素酶相比，分別多保持了4.5%～10%和7.3%～8.7%的酶活性。關(guān)于酶活性隨時間的變化，謝曉麗[28]的研究表明，超聲處理后的纖維素酶在放置10 h后，各個樣品的酶活力有顯著降低，而經(jīng)過48 h后酶活力降至低于原酶活力，甚至28 kHz處理下的樣品酶活性比原酶活性降低了68.97%。石文奇等[27]發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶隨放置時間的延長（0～60 min）而其活性也出現(xiàn)了不同程度的降低。由此可見，在一定的條件下，酶類活性隨著放置時間的延長而降低。在酶解反應之前對半纖維素酶和纖維素酶進行處理，不僅能提高其活性，而且可使其在一定時間內(nèi)可以保持較高的活性。因此，放置時間在5 h內(nèi)，經(jīng)超聲波處理后的兩種水解酶，與未經(jīng)超聲處理的樣品相比較均可保持較高的活性，對黍子谷殼具有較好的酶解能力。

圖8 不同貯存時間對半纖維素酶活性的影響圖（n=5）

綜上所述，半纖維素酶和纖維素酶在超聲功率分別為480 W和120 W，超聲時間為4 min時，其酶活性顯示最大值。經(jīng)超聲波處理后的兩種酶，在0～5 h放置時間內(nèi)，其與未處理相比仍然保持了較高的酶活性且差異明顯（p＜0.05）。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，半纖維素酶和纖維素酶的最佳酶解條件分別是：pH值為5.0和5.5，水浴溫度均為40 ℃，水浴時間均為15 min。超聲處理半纖維素酶和纖維素酶的最佳條件分別是：超聲功率為480 W和120 W，超聲時間均為4 min。在此條件下，半纖維素酶和纖維素酶分別可將黍子谷殼中的半纖維素和纖維素最大限度的轉(zhuǎn)化為可被利用的糖類分子。同時，在0～5 h的放置時間內(nèi)，超聲處理后的兩種酶與未處理時相比均可保持了較高的酶活性。本研究為黍子谷殼的綜合開發(fā)利用提供了新的思路和理論依據(jù)，也使超聲波技術(shù)在食品酶類研究中的應用得到了拓展。