陳余佳, 涂曉盟, 王永強(qiáng), 王全喜, 許麗麗

(上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

0 引 言

傳統(tǒng)化工能源在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生含硫及含氮污染物,新能源的開(kāi)發(fā)利用已成為一項(xiàng)迫切的任務(wù)[1].在生產(chǎn)過(guò)程中,生物質(zhì)能源通過(guò)光合作用將空氣中的二氧化碳轉(zhuǎn)化成有機(jī)物儲(chǔ)存,其在燃燒時(shí)又把二氧化碳再次釋放到大氣中,因此被認(rèn)為是一種新型的低排放、低污染的清潔能源[2].藻類可以通過(guò)光合作用將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為氧氣、碳水化合物或者脂質(zhì)形式的大分子有機(jī)物[3].在某些脅迫條件下,如高光或營(yíng)養(yǎng)缺乏,一些藻類可積累大量脂質(zhì),如三酰甘油酯等[4-5].由于微藻生長(zhǎng)速度快,脂質(zhì)含量高,又被認(rèn)為是生產(chǎn)生物柴油的理想材料[4-5].目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)油量高的藻類主要包括金藻(Chrysophytes)、定鞭藻(Haptophytes)、雙鞭毛蟲(chóng)(Dinophytes)、黃藻(Xanthophyceae)、紅藻(Rhodophytes)和萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)等.它們?cè)谡－h(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)的平均油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為干重的27.1%,處于環(huán)境脅迫條件下時(shí)則可上升到44.6%[4].相比其他藻類,萊茵衣藻(以下簡(jiǎn)稱衣藻)是一種單細(xì)胞綠藻,其基因組已被完全測(cè)序,便于進(jìn)行遺傳研究,且生長(zhǎng)快,培養(yǎng)成本低,在缺氮條件下能產(chǎn)生油脂,被認(rèn)為是油脂生產(chǎn)研究的模式物種[6].與其他微藻類一樣,衣藻在缺氮條件下的生長(zhǎng)受到抑制,其生物量與油脂的積累及缺氮程度呈負(fù)相關(guān)[6-8],這導(dǎo)致其脂質(zhì)生產(chǎn)效率及積累量均低于理論值.因此,探明衣藻油脂積累的最佳條件,是當(dāng)前藻類產(chǎn)油的研究熱點(diǎn).本研究設(shè)置不同氮含量的培養(yǎng)基,在不同光照條件下進(jìn)行衣藻產(chǎn)油誘導(dǎo),并測(cè)定衣藻的生物量及油脂含量,以確定最適于衣藻油脂積累環(huán)境的氮含量.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)方法

選用的衣藻藻種為衣藻(C.reinhardtii)cc849,購(gòu)自美國(guó)杜克大學(xué)藻種庫(kù),其正常培養(yǎng)條件為:溫度 (25±1) ℃,水平搖床轉(zhuǎn)速 120 r·min-1,光照強(qiáng)度 0～200 μE·m-2·s-1,培養(yǎng)基為Tris-Acetate-Phosphate(TAP) (pH=7.0),液體培養(yǎng)每5 d繼代1次,接種量為1%;固體TAP培養(yǎng)基含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂,藻種的純化和保存是以藻液或單克隆通過(guò)劃線方法接種在TAP瓊脂平板上,每二周繼代1次[9].用相等物質(zhì)的量的氯化鈉替換正常TAP培養(yǎng)基內(nèi)的氯化銨來(lái)配制缺氮培養(yǎng)基(TAP-N)以培養(yǎng)衣藻產(chǎn)油[9-10].

1.2 衣藻的缺氮培養(yǎng)

當(dāng)培養(yǎng)瓶中的衣藻細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期(約2～3 d)時(shí),在25℃溫度下,以3500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,棄上清,使用TAP-N培養(yǎng)基緩慢洗滌藻細(xì)胞3次,以徹底除去氮[8].用TAP-N培養(yǎng)基洗滌過(guò)的衣藻,按照體積分?jǐn)?shù)1%接種量加入到容積為500 mL的培養(yǎng)瓶中.然后用TAP-N培養(yǎng)基及TAP培養(yǎng)基定容混合培養(yǎng)液400 mL,使得培養(yǎng)基中氮的質(zhì)量濃度分別為100,200,300 mg·mL-1,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶中的樣品,使藻類懸浮均勻.用TAP-N培養(yǎng)基及正常TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)的衣藻樣品作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組.最后將培養(yǎng)瓶分別置于光照強(qiáng)度為30,60,100,200 μE·m-2·s-1的光照條件下進(jìn)行缺氮培養(yǎng).

1.3 衣藻生長(zhǎng)的測(cè)定

衣藻在750 nm處的吸光度(OD750)值與其細(xì)胞數(shù)正相關(guān),因此可用分光光度計(jì)測(cè)定衣藻的OD750值來(lái)反映衣藻的生長(zhǎng)情況[10].所用分光光度計(jì)為TU-1901雙光束可見(jiàn)-紫外光分光光度計(jì)(北京普析通用有限責(zé)任公司).衣藻葉綠素含量的測(cè)定是用95%(體積分?jǐn)?shù))酒精萃取,測(cè)定OD665值(A665)和OD649值(A649),計(jì)算出衣藻中的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)及總?cè)~綠素(Chl)的質(zhì)量濃度(CChla,CChlb,CCh1)(單位為mg·L-1),計(jì)算公式[10]為:

CChl=CChla+CChlb= 6.10×A665+ 20.04×A649,

(1)

并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),取平均值.

1.4 衣藻油脂的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[11]的方法檢測(cè)衣藻中的油脂含量,并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù).提取400 mL藻細(xì)胞,以3500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,然后用新鮮的TAP-N培養(yǎng)基洗滌3次,之后將固體樣品放入干燥的稱量瓶中在溫度80 ℃的烘箱中干燥24 h,直到質(zhì)量不再減少為止.稱取0.2 g的干細(xì)胞(質(zhì)量記為W0),將其轉(zhuǎn)移到離心管中,然后將5 mL的氯仿和甲醇的混合物(體積比為1∶1)加入到離心管中.將離心管中的細(xì)胞和混合物在振蕩器上震蕩30 min,然后以5000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液.重復(fù)以上步驟直到萃取的上清液為無(wú)色.收集所有上清液(質(zhì)量記為W1),并轉(zhuǎn)移至質(zhì)量已知的干燥旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至干燥(質(zhì)量記為W2).總脂含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

Ct= (W2-W1)/W0×100%.

(2)

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的油脂產(chǎn)量的差異,顯著性水平設(shè)定為p<0.05.顯著性差異的結(jié)果用*標(biāo)注在相應(yīng)的圖中.同時(shí)本文作者采用雙因素方差分析探索了光照、氮,以及光照和氮的交互作用對(duì)油脂產(chǎn)量的影響.所有數(shù)據(jù)處理過(guò)程均在SPSS 19.0中完成.

2 結(jié)果與分析

2.1 氮濃度對(duì)衣藻生長(zhǎng)的影響

以TAP-N培養(yǎng)基及正常TAP培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,對(duì)不同氮濃度脅迫下的衣藻在不同光照強(qiáng)度下的油脂產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖1所示.

當(dāng)光照強(qiáng)度為30 μE·m-2·s-1,培養(yǎng)基中氮的質(zhì)量濃度分別為0 (TAP-N),100,200,300和375 mg·L-1(TAP培養(yǎng)基)時(shí),衣藻的OD750值隨著培養(yǎng)時(shí)間增加逐漸增長(zhǎng),至第7 d時(shí)達(dá)到最大值,分別為0.08,1.61,1.61,1.62和1.75,如圖1(a)所示;衣藻的葉綠素質(zhì)量濃度也隨著培養(yǎng)時(shí)間增加逐漸增長(zhǎng),最初為0.35 mg·mL-1,至第7 d時(shí)達(dá)到最大值,分別為0.04,7.08,17.87,26.01,27.84 mg·mL-1,如圖1(b)所示.相對(duì)于TAP培養(yǎng)基中的衣藻,缺氮條件下衣藻的生長(zhǎng)受到了抑制,尤其在完全缺氮(TAP-N)條件下,本研究結(jié)果顯示:在第7 d,衣藻的生長(zhǎng)受到明顯的抑制,OD750值比TAP條件下的降低了97.3%,葉綠素質(zhì)量濃度降低了99.8%.當(dāng)培養(yǎng)基中氮的質(zhì)量濃度為100,200,300 mg·L-1時(shí),所培養(yǎng)衣藻的OD750值分別比TAP條件下的值降低了45.8%,45.8%和45.5%.葉綠素的質(zhì)量濃度下降更為顯著,分別比TAP條件下的值降低了74.6%、35.8%和6.6%.其他培養(yǎng)時(shí)間均有類似的趨勢(shì),但是抑制效果沒(méi)有第7 d的明顯.

同30 μE·m-2·s-1類似,當(dāng)光照強(qiáng)度為60 μE·m-2·s-1和100 μE·m-2·s-1條件時(shí),衣藻的OD750值和葉綠素質(zhì)量濃度也隨著培養(yǎng)時(shí)間增加逐漸增長(zhǎng),如圖1(c)～1(f)所示.在完全缺氮條件下,在第7 d時(shí)分別達(dá)到最大值,OD750值分別為2.96和3.01,如圖1(c),1(e)所示;葉綠素質(zhì)量濃度最大值分別為29.26 mg·mL-1和28.88 mg·mL-1,如圖1(d),1(f)所示.由結(jié)果可知,在光照強(qiáng)度為60 μE·m-2·s-1和100 μE·m-2·s-1時(shí),缺氮后的衣藻生長(zhǎng)都同樣受到了影響,尤其是TAP-N條件下,衣藻的OD750值比對(duì)照組TAP條件下的值降低了92.9%～97.0%,葉綠素濃度降低了98.8%～99.4%.其他培養(yǎng)時(shí)間均有類似的趨勢(shì),但是抑制效果沒(méi)有第7 d的明顯.

圖1 不同氮質(zhì)量濃度下,衣藻OD750值與葉綠素質(zhì)量濃度隨時(shí)間增長(zhǎng)的變化.光照強(qiáng)度為(a),(b)30 μE·m-2·s-1;(c),(d) 60 μE·m-2·s-1;(e),(f) 100 μE·m-2·s-1

2.2 氮濃度對(duì)衣藻油脂積累的影響

由圖1可知,盡管氮濃度及光照強(qiáng)度條件不同,但衣藻的生長(zhǎng)在第2 d基本處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)時(shí)期.因此,為了統(tǒng)一培養(yǎng)時(shí)間,本文作者檢測(cè)了衣藻在不同光照強(qiáng)度及氮濃度條件下培養(yǎng)至第2 d的油脂含量,結(jié)果如圖2,表1所示.由圖2可知,缺氮脅迫可以促進(jìn)衣藻體內(nèi)油脂的積累,氮濃度越低衣藻的總脂含量越高,在3個(gè)光照強(qiáng)度下,完全缺氮條件(0 mg·L-1,TAP-N)下衣藻的總脂含量最大,顯著高于氮質(zhì)量濃度為100,200,300,375 mg·L-1時(shí)的(p<0.05).當(dāng)光照強(qiáng)度為30 μE·m-2·s-1時(shí),TAP-N培養(yǎng)基培養(yǎng)的衣藻的總脂含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為48.6%,大約是TAP培養(yǎng)條件下的3.2倍,其他氮濃度條件下衣藻的總脂含量大約分別是對(duì)照組TAP條件下的2.7,2.4和1.7倍.當(dāng)光照強(qiáng)度為60 μE·m-2·s-1時(shí),衣藻的油脂產(chǎn)量也隨著氮濃度的增多逐漸降低,尤其是完全缺氮的情況下總脂含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))最高為42.2%,大約是對(duì)照組TAP條件下的3.2倍,其他氮濃度條件下的總脂含量大約分別是對(duì)照組條件下的2.5,1.8和1.4倍.同樣地,當(dāng)光照強(qiáng)度為100 μE·m-2·s-1時(shí),衣藻的總脂含量也隨著氮濃度的增多逐漸降低,完全缺氮的情況下總脂含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))最高為39.2%,大約是對(duì)照組TAP條件下的3.3倍,其他氮濃度條件下的總脂含量大約分別是對(duì)照組TAP條件下的3.0,2.9和1.9倍.通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析可知,缺氮條件下培養(yǎng)的衣藻的總脂含量相比于TAP培養(yǎng)基中的衣藻的總脂含量均有顯著性提高(p<0.05).

圖2 不同光照強(qiáng)度及氮濃度條件下衣藻在第2 d的總脂含量.*表示通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組具有顯著性差異

表1 不同光照強(qiáng)度及氮濃度條件下衣藻在第2 d的總脂含量

2.3 衣藻油脂積累的影響因素分析

由圖1和表2可知,光照強(qiáng)度和氮質(zhì)量濃度都能對(duì)衣藻的油脂積累量產(chǎn)生影響.利用雙因素方差分析了第2 d的數(shù)據(jù).結(jié)果表明,光照強(qiáng)度、氮質(zhì)量濃度及這2個(gè)因素的交互作用對(duì)總脂含量的影響都是顯著的(p<0.05).光照強(qiáng)度與油脂積累量成負(fù)關(guān)聯(lián),油脂積累量隨氮質(zhì)量濃度增加而減小(圖2,表1).這說(shuō)明,光照強(qiáng)度為30 μE·m-2·s-1和低氮濃度條件下衣藻的總脂含量最優(yōu),在探究影響衣藻總脂含量時(shí)需同時(shí)考慮這兩個(gè)因素的作用.

表2中,df表示自由度;F為檢驗(yàn)的數(shù)值;p為相應(yīng)的影響因素對(duì)總酯含量影響的顯著性水平;R2為決定系數(shù),表示雙因素方差分析整體可信程度,R2越高,表示雙因素方差分析的結(jié)果越可信.R2=0.98.

表2 光照強(qiáng)度和氮質(zhì)量濃度對(duì)總脂含量影響的雙因素方差分析結(jié)果

3 討 論

自然條件下微藻體內(nèi)的油脂含量相對(duì)比較低,但是在氮濃度不足的情況下,脂肪和碳水化合物產(chǎn)量會(huì)増加,因此大部分的微藻產(chǎn)油都是基于缺氮條件培養(yǎng).SIAUT等[12]研究發(fā)現(xiàn),衣藻的油脂積累量與其生物量有直接關(guān)系,同時(shí)也會(huì)受到光照強(qiáng)度、pH值等其他因素的影響[13].本研究設(shè)置了5個(gè)不同的氮濃度及3個(gè)不同的光照強(qiáng)度梯度以探究衣藻產(chǎn)油的適宜條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:缺氮條件下衣藻的生長(zhǎng)受到抑制,尤其是葉綠素含量相對(duì)于正常TAP培養(yǎng)基中的衣藻受到嚴(yán)重抑制,由于氮元素是葉綠素的主要組成部分,因此缺氮后衣藻的葉綠素合成受到較大影響,可以進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)衣藻的光系統(tǒng)二的活性來(lái)驗(yàn)證.KIM等[13]指出:光照強(qiáng)度過(guò)大,衣藻細(xì)胞容易受到光損傷,而較低的光照強(qiáng)度下衣藻細(xì)胞的光合作用較弱,也不利于其生物量的積累,因此很有必要尋找衣藻生物量積累的適宜光照強(qiáng)度.本研究利用雙因素方差分析光照強(qiáng)度和氮濃度對(duì)衣藻油脂積累量的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),光照強(qiáng)度和氮濃度都對(duì)油脂積累具有重要作用.結(jié)合t檢驗(yàn)對(duì)比分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),利于衣藻生物量積累的最佳光照強(qiáng)度為30 μE·m-2·s-1.同時(shí),與HU等[14]和WANG等[15]的研究結(jié)果相同.本研究結(jié)果顯示衣藻在完全缺氮(TAP-N)狀態(tài)下的油脂含量增加最為顯著.但是考慮到生物量因素,選取最佳氮質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1為宜.當(dāng)光照強(qiáng)度30 μE·m-2·s-1,氮質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1時(shí),衣藻的油脂積累量取得最優(yōu)值,為39.79%(表1).此外,由于本研究中設(shè)置的初始衣藻細(xì)胞濃度過(guò)低(OD750僅為0.34),導(dǎo)致了完全缺氮條件下衣藻的生物量極低,而氮濃度設(shè)置梯度過(guò)大,這導(dǎo)致較低水平的氮含量培養(yǎng)的衣藻生物量偏差太大.因此在今后的研究中,應(yīng)提高衣藻的初始細(xì)胞濃度,并縮小氮濃度梯度間隔.

4 結(jié) 論

檢測(cè)了不同氮濃度下及光照強(qiáng)度下衣藻的油脂產(chǎn)量,結(jié)果顯示,氮濃度和光照強(qiáng)度都對(duì)衣藻油脂積累量存在顯著影響,利用衣藻產(chǎn)油時(shí),需綜合考慮這兩個(gè)因素.本研究得出衣藻最佳積累油脂的氮質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1,光照強(qiáng)度為30 μE·m-2·s-1.