樊江波，張格林

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710004；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，西安 710004)

芫花素為益母草中的活性物質(zhì)。益母草為傳統(tǒng)中藥，主治痛經(jīng)、閉經(jīng)、產(chǎn)后出血、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后子宮恢復(fù)不良、產(chǎn)后惡露不盡及赤白帶下等癥[1]。

Fan J B等[2]用SD大鼠子宮平滑肌CMC-online-HPLC/MS方法篩選出益母草的活性成分之一為芫花素。本實(shí)驗(yàn)研究芫花素對(duì)藥物流產(chǎn)模型大鼠子宮出血量、凝血時(shí)間、雌二醇、孕酮水平及子宮、卵巢病理形態(tài)的影響，同時(shí)研究了芫花素對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮復(fù)舊及子宮內(nèi)膜修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β影響的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 UV1600比例雙光束紫外可見分光光度計(jì)(浙江福立分析儀器有限公司)；GENIUS 5K型低速離心機(jī)(長沙鑫奧儀器儀表有限公司)；680型酶標(biāo)儀(日本BIO-RAD公司)；Elisa反應(yīng)板(美國Waters公司)；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(北京昊諾斯科技有限公司)；XSP-C204型顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；羅氏Cobas 6000 E601電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(瑞士羅氏公司)。

1.2試藥 芫花素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.5%，批號(hào)BBP00737)，購自云南西麗生物技術(shù)有限公司；宮血寧膠囊(規(guī)格：0.13 g×18粒，批號(hào)ZI12005)，購自云南白藥集團(tuán)股份有限公司；米非司酮片(規(guī)格：25 mg×6片，批號(hào)121201)，購自浙江仙琚制藥股份有限公司；米索前列醇(200 μg×3片，批號(hào)43110104161)，購自北京紫竹藥業(yè)有限公司；TNF-α和IL-1β血清酶免試劑盒，均購自上?？迫A公司；甲醛溶液(批號(hào)20111225),購自廣東光華科技股份有限公司；二甲苯(批號(hào)081023),購自四川西隴化工有限公司。

1.3動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，雌性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～220 g。均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 雌鼠10只作為空白對(duì)照組，其余60只雌性SD大鼠與30只雄性SD大鼠進(jìn)行合籠交配，合籠比例為2∶1，觀察到成功交配后，在次日清晨取雌性SD大鼠，檢查其陰栓，并進(jìn)行陰道液涂片，用顯微鏡檢查精子，鏡下查到陰栓及精子者52例，記錄為受孕第1 d。取50只受孕大鼠，均分為5組，每組10只，分別為模型組、陽性對(duì)照組、芫花素低劑量組(0.1 mg·kg-1)、芫花素中劑量組(0.2 mg·kg-1)和芫花素高劑量組(0.4 mg·kg-1)。

2.2流產(chǎn)模型的建立 于妊娠第7 d上午8點(diǎn)和下午18點(diǎn)，分別給予50只孕鼠灌胃米非司酮(8 mg·kg-1，0.01 mL·g-1)和米索前列醇(100 μg·kg-1，0.01 mL·g-1)制作藥物流產(chǎn)模型。

2.3給藥方法 給予米非司酮流產(chǎn)次日，全部大鼠開始灌胃給藥；空白對(duì)照組不給藥；模型組給予生理鹽水10 mL·kg-1；陽性對(duì)照組給予宮血寧10 mg·kg-1；芫花素低、中和高劑量組分別給予芫花素0.1，0.2和0.4 mg·kg-1。以上用藥，每日1次，連續(xù)7 d。

2.4檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1大鼠子宮出血量 給予大鼠米非司酮的同一天開始，在其陰道內(nèi)放置40 mg無菌棉球，每日更換，連續(xù)5 d。將每日從大鼠陰道中取出的棉球收集在一起，放入密閉的試管中于0～4 ℃保存。在大鼠受孕后第14 d，從其眼眶靜脈叢中取血20 μL，用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉溶液2 mL溶解；將每只大鼠所收集到的棉球，用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉溶液5 mL浸泡溶解24 h，將棉球充分?jǐn)D壓，使其中的血液完全浸出，將浸出液進(jìn)行過濾。用分光光度計(jì)于546 nm波長處分別測(cè)定每只動(dòng)物的靜脈血溶解液及棉球血溶解液A值。計(jì)算每只動(dòng)物的子宮出血量。

子宮出血量(μL)=[靜脈血量(μL)×棉球血浸提A1值×浸泡棉球血?dú)溲趸c體積(mL)]÷[靜脈血A2值×靜脈血稀釋用氫氧化鈉體積(mL)]

2.4.2大鼠血漿凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間及部分凝血活酶時(shí)間 末次給藥后24 h，大鼠腹腔注射100 mL·L-1水合氯醛(0.003 5 mL·L-1)，經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血，用質(zhì)量濃度為3.8 g·L-1的枸櫞酸鈉抗凝(抗凝劑∶血液=1∶9)充分離心后取血漿，用血凝分析儀測(cè)定大鼠血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)以及部分凝血活酶時(shí)間(APTT)。

2.4.3血清中雌二醇和孕酮水平 經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血5 mL，離心取血清，用羅氏Cobas 6000 E601電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定血清中的雌二醇(E2)和孕酮(P)的質(zhì)量濃度。

2.4.4血清中TNF-α和IL-1β的含量 經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL，離心，取大鼠血清50 μL，測(cè)定TNF-α，取血清100 μL，測(cè)定IL-1β。

2.4.5大鼠子宮和卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 剖腹取全例大鼠子宮及一側(cè)卵巢，將大鼠子宮及卵巢標(biāo)本置于100 mL·L-1甲醛溶液中固定，24 h后將固定好的子宮及卵巢組織塊經(jīng)常規(guī)的乙醇進(jìn)行梯度脫水，用二甲苯進(jìn)行透明，常規(guī)將子宮及卵巢組織塊石蠟包埋，制成子宮及卵巢組織蠟塊，置于4 ℃冰箱中保存待用。蠟塊用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)連續(xù)組織切片，切片厚度為3 μm。常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢和子宮的病理變化。

2.5統(tǒng)計(jì)分析 釆用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1對(duì)子宮出血量和凝血酶時(shí)間的影響 大鼠給藥后，陽性對(duì)照組子宮出血量較模型組減少(P<0.01)；芫花素中、高劑量組子宮出血量較模型組減少，且存在劑量依賴性。模型組大鼠PT和TT較空白對(duì)照組顯著延長(P<0.05)；陽性對(duì)照組及芫花素中、高劑量組大鼠PT及TT較模型組短。見表1。結(jié)果表明，芫花素能減少藥物流產(chǎn)大鼠的子宮出血量，對(duì)藥物流產(chǎn)后子宮出血有治療作用。藥物流產(chǎn)引起大鼠PT和TT延長，芫花素能縮短藥物流產(chǎn)大鼠的PT和TT。

表1芫花素對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮出血量和凝血酶時(shí)間的影響

組別劑量/mg·kg-1子宮出血量/μL PT/s TT/sAPTT/s空白對(duì)照組10.8±0.66?25.1±2.70?35.8±4.82模型組206.0±59.712.8±1.9528.5±2.3632.6±5.04陽性對(duì)照組10135.4±21.5??10.1±0.92??25.0±3.26?34.8±4.19芫花素低劑量組0.1178.5±68.711.0±1.2627.3±1.5534.5±4.76芫花素中劑量組0.2155.1±25.8?10.7±1.22?25.4±1.86?35.9±4.79芫花素高劑量組0.4133.9±13.9??10.4±0.56??24.9±2.17?36.1±4.41

注：與模型組比較，*P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2對(duì)雌二醇、孕酮水平及血清中TNF-α和IL-1β的影響 模型組大鼠血清雌二醇質(zhì)量濃度降低，而孕酮升高，與空白對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對(duì)照組及芫花素中、高劑量組藥物流產(chǎn)大鼠血清中雌二醇質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05)。模型組大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量顯著升高，與空白對(duì)照組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照組及芫花素中、高劑量組藥物流產(chǎn)大鼠體內(nèi)TNF-α和IL-1β含量顯著降低。見表2。結(jié)果表明，芫花素可升高藥物流產(chǎn)大鼠體內(nèi)雌二醇質(zhì)量濃度和降低藥物流產(chǎn)大鼠體內(nèi)TNF-α和IL-1β含量。

表2芫花素對(duì)流產(chǎn)大鼠體內(nèi)雌二醇、孕酮水平及血清中TNF-α和IL-1β的影響

組別劑量/mg·kg-1雌二醇/ng·mL-1孕酮/ng·mL-1TNF-α/ng·mL-1IL-1β/ng·mL-1空白對(duì)照組151.6±34.7??12.0±4.14?? 62.15±7.28?? 4.38±0.83??模型組 95.7±8.117.9±4.79115.39±18.1712.51±1.27陽性對(duì)照組10131.1±17.9??14.1±3.72 91.56±15.93? 8.72±0.93?芫花素低劑量組0.1103.2±18.315.2±7.41107.21±18.0311.79±0.98芫花素中劑量組0.2114.6±24.3?13.6±6.78 96.85±13.43? 9.02±0.83?芫花素高劑量組0.4120.7±23.7??15.2±6.77 93.74±11.27? 8.68±0.68?

注：與模型組比較，*P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3芫花素對(duì)卵巢、子宮病理形態(tài)的影響 見圖1。由圖1可知，各組動(dòng)物的卵巢組織結(jié)構(gòu)正常，皮髓質(zhì)分界清楚，多級(jí)卵泡可見，不同發(fā)育階段黃體可見，組間比較無明顯差異。模型組子宮內(nèi)膜較薄，大部分存在內(nèi)膜不完整或脫落，內(nèi)膜呈低柱狀或立方狀，子宮腔比正常大鼠略大，肌層與空白對(duì)照組相比較薄。陽性對(duì)照組及芫花素中、高劑量組各例子宮的漿膜、肌層、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)清楚，黏膜覆單層柱狀上皮，完整無脫落。固有膜中可見單管狀子宮腺。子宮腔大小基本正常，肌層較厚，與正常大鼠基本相同。子宮內(nèi)膜未見增生過長。

圖1芫花素對(duì)卵巢、子宮病理形態(tài)的影響(100×)

①空白對(duì)照組子宮；②模型組子宮；③陽性對(duì)照組子宮；④芫花素低劑量組子宮；⑤芫花素中劑量組子宮；⑥芫花素高劑量組子宮；⑦空白對(duì)照組卵巢；⑧模型組卵巢；⑨陽性對(duì)照組卵巢；芫花素低劑量組卵巢；芫花素中劑量組卵巢；芫花素高劑量組卵巢。

Fig.1 Effects of genkwanin on uterus，ovarian pathological morphology in the medical-abortion rat (100×)

①uterus of blank control group；②uterus of model group；③uterus of positive control group；④uterus of low dose genkwanin group；⑤uterus of middle dose genkwanin group；⑥uterus of high dose genkwanin group；⑦ovarian of blank control group；⑧ovarian of model group；⑨ovarian of positive control group；ovarian of low dose genkwanin group；ovarian of middle dose genkwanin group；ovarian of high dose genkwanin group.

4 討論

研究結(jié)果表明，芫花素可有效減少藥物流產(chǎn)大鼠的子宮出血量，縮短大鼠PT和TT，升高藥物流產(chǎn)大鼠體內(nèi)雌二醇的質(zhì)量濃度，對(duì)藥物流產(chǎn)后子宮出血有治療作用?？赡芘c芫花素可促進(jìn)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜增生恢復(fù)、促進(jìn)子宮平滑肌收縮、導(dǎo)致流產(chǎn)大鼠子宮腔較快時(shí)間恢復(fù)至正常大小有關(guān)。這也為產(chǎn)后子宮復(fù)舊不良、惡露不凈的治療提供了依據(jù)，通過進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，芫花素有望用于臨床治療產(chǎn)后子宮復(fù)舊不良等。

病理研究表明，模型組10例中有6例子宮內(nèi)膜不完整或脫落，子宮腔比正常大鼠略大；陽性對(duì)照組子宮內(nèi)膜較厚，表面被覆單層柱狀上皮，子宮腔較小，接近空白對(duì)照組；芫花素低劑量組子宮內(nèi)膜為單層柱狀、低柱狀或立方狀上皮，10例中有2例內(nèi)膜不完整或脫落，子宮腔略大于正常對(duì)照組；芫花素低劑量組10例中有2例內(nèi)膜不完整或脫落，子宮腔略大于空白對(duì)照組；芫花素中、高劑量組子宮內(nèi)膜為單層柱狀上皮，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)清楚，完整無脫落，子宮腔大小正常。病理結(jié)果提示，芫花素可促進(jìn)藥物流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜增生恢復(fù)，促進(jìn)子宮平滑肌收縮，恢復(fù)子宮腔正常大小。

產(chǎn)后子宮復(fù)舊不良的機(jī)制可能與卵巢激素、內(nèi)膜修復(fù)及止血過程有關(guān)。韓秀君等[3]用益母草治療產(chǎn)后子宮復(fù)舊不良及惡露不凈；李春梅等[4]研究產(chǎn)后子宮復(fù)舊以及子宮內(nèi)膜的修復(fù)機(jī)制，表明益母草對(duì)子宮蛻膜崩解、內(nèi)膜修復(fù)、排出惡露及調(diào)節(jié)子宮張力作用良好。

TNF-α具有雙重作用，一方面在機(jī)體生理功能和抗感染等方面發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的重要作用，另一方面若TNF-α持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多則呈現(xiàn)其毒性作用，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)劇烈。NF-κB可調(diào)控TNF-α的產(chǎn)生，而TNF-α釋放增加又促進(jìn)了IκB的磷酸化，這使NF-κB進(jìn)一步激活，從而延續(xù)炎癥反應(yīng)的復(fù)雜環(huán)路調(diào)節(jié)，導(dǎo)致了最初的炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大[5-7]。子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生與NF-κB途徑的激活密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，可通過抑制NF-κB信號(hào)通路達(dá)到減弱子宮內(nèi)膜炎癥[8-10]，促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)[11-13]。白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)又名淋巴細(xì)胞刺激因子，在機(jī)體中發(fā)揮著重要的作用，在細(xì)胞免疫的激活過程中具有調(diào)節(jié)作用[14-15]。在機(jī)體中，IL-1β參與許多生理過程，能刺激PDGF、集落刺激因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16-18]，在組織修復(fù)和免疫應(yīng)答過程中起重要作用[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)研究了芫花素對(duì)藥物流產(chǎn)大鼠子宮復(fù)舊及子宮內(nèi)膜修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β含量的影響，芫花素中、高劑量組能顯著降低藥物流產(chǎn)大鼠體內(nèi)的TNF-α和IL-1β含量(P<0.05)，提示芫花素可能參與了子宮復(fù)舊及子宮內(nèi)膜修復(fù)過程，能減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)子宮復(fù)舊及子宮內(nèi)膜修復(fù)。