劉凡，仇鈺瑩，周新虎，陳翔，李喆，陳堅(jiān)，堵國(guó)成，方芳*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122) 3(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷,223800) 4(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122) 5(江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122)

濃香型白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的酒精飲料，其產(chǎn)銷量居各香型白酒之首，以“窖香濃郁、綿柔醇厚、口感綿甜和尾凈余長(zhǎng)”的風(fēng)格著稱[1-2]。有機(jī)酸是濃香型白酒中重要的呈味物質(zhì)，適當(dāng)比例的有機(jī)酸能使酒體更加飽滿，有利于消除白酒中的苦味并促進(jìn)新酒老熟[3-4]。己酸、乳酸、乙酸和丁酸占白酒中有機(jī)酸含量的90%以上，被稱為白酒的“四大酸”，其含量和比例的變化對(duì)白酒風(fēng)味形成具有重要作用[5]。四大酸一方面是白酒中主要酯類物質(zhì)如乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯(濃香型白酒的主體香味物質(zhì))和丁酸乙酯合成的重要前體，其含量決定了濃香型白酒香型的形成[6-7]；另一方面，白酒中四大酸含量適宜時(shí)有助于白酒風(fēng)味的提升，而任一有機(jī)酸過(guò)量時(shí)則會(huì)破壞白酒風(fēng)味組成平衡。例如，己酸對(duì)白酒有呈味助香的功能，其濃度過(guò)高則導(dǎo)致酒體渾濁。丁酸具有愉悅的水果香味，能顯著增強(qiáng)白酒“窖香”，但過(guò)量則有不愉快的汗臭味[8]產(chǎn)生。乳酸能抑制有害微生物的繁殖，在穩(wěn)定白酒香氣，降低酒體苦澀和糙辣感方面也有重要作用，過(guò)量乳酸存在則會(huì)導(dǎo)致酒體酸澀，影響白酒口感[9]。乙酸能有效烘托和緩和白酒主體香味，過(guò)量乙酸則會(huì)破壞酒體風(fēng)格，抑制白酒香味[10]。

目前，通過(guò)分離產(chǎn)酸微生物并分析菌株的生理生化特性和產(chǎn)酸性能等相關(guān)研究證實(shí)細(xì)菌是濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的主要產(chǎn)生者[11-12]。其中，梭狀芽孢桿菌是丁酸和己酸合成的主要微生物。梭狀芽孢桿菌在酒醅中的含量極少(相對(duì)豐度<0.01%)，主要存在(自然存在或人工強(qiáng)化)于窖泥中[13]。此外，醋桿菌有較強(qiáng)合成乙酸的能力，而以乳桿菌屬為主的乳酸菌是乳酸合成的重要微生物，乳桿菌進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵代謝時(shí)也能產(chǎn)生乙酸[14]。上述研究?jī)H驗(yàn)證了分離出的微生物具有代謝產(chǎn)生有機(jī)酸的能力，并未闡明相應(yīng)產(chǎn)酸微生物尤其是與乙酸和乳酸合成相關(guān)的微生物在白酒發(fā)酵不同階段以及真實(shí)混菌發(fā)酵體系中對(duì)有機(jī)酸合成的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段雖已廣泛應(yīng)用于分析白酒微生物群落與代謝產(chǎn)物合成的相互關(guān)系[15-16]，然而，通過(guò)分離微生物并研究其代謝能力仍是闡釋白酒發(fā)酵機(jī)制和提高白酒品質(zhì)的根本途徑[17]。因此，在獲得可培養(yǎng)微生物的前提下，結(jié)合分子生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析揭示白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物與有機(jī)酸合成的相互關(guān)系對(duì)提升白酒風(fēng)味具有重要意義。

通過(guò)分離產(chǎn)酸微生物并驗(yàn)證菌株產(chǎn)有機(jī)酸的能力，將產(chǎn)酸微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)變化與白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程酒醅中有機(jī)酸含量變化進(jìn)行相關(guān)性分析，由此確定白酒發(fā)酵不同階段對(duì)乳酸、乙酸合成有重要影響的功能微生物，為闡釋白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程的微生物產(chǎn)酸機(jī)理和提高白酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒醅樣品

濃香型白酒酒醅取自江蘇洋河酒廠股份有限公司濃香型白酒生產(chǎn)窖池。采樣方式：分別在窖池上、中、下3層采集樣品，混勻后作為1個(gè)酒醅樣品。在60 d的發(fā)酵周期內(nèi)，分別取發(fā)酵0、3、6、15、20、30、45和60 d的酒醅樣品，各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品均取自2個(gè)不同的窖池，并及時(shí)保存于-20 ℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌篩選培養(yǎng)基(g/L): MRS培養(yǎng)基，輕質(zhì)CaCO35.0(單獨(dú)滅菌，倒平板前加入)，鈉他霉素0.05，瓊脂20.0。

醋酸菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母膏10.0，輕質(zhì)CaCO35.0(單獨(dú)滅菌，倒平板前加入)，鈉他霉素 0.05，瓊脂 20.0。培養(yǎng)基使用前加30 g/L的無(wú)水乙醇。

其他產(chǎn)酸細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、輕質(zhì)CaCO35.0(單獨(dú)滅菌，倒平板前加入)，瓊脂20.0。

糧食浸出培養(yǎng)基：將生產(chǎn)洋河濃香型白酒所用五糧(高粱、小麥、玉米、糯米、和大米)按比例混合粉碎，添加4倍體積水和高溫淀粉酶(1 000 U/kg)蒸煮糊化1 h，迅速冷卻至60 ℃以下后加入糖化酶(3 000 U/kg)，于60 ℃下糖化2 h，紗布過(guò)濾，上清液調(diào)整糖度至13～14 ° Bx。

1.2 主要試劑和儀器

乳酸和乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥99.5%),Sigma-Aldrich公司；Primer STAR?Max DNA Polymerase、SYBR?PremixEx TaqTMⅡ：大連寶生物工程有限公司;PowerMax?Soil DNA isolation kit試劑盒：MOBIO公司；鈉他霉素：青島寶博公司；其他試劑均購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高效液相色譜儀(安捷倫1260)，美國(guó)安捷倫公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher公司；PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；羅氏LightCycler?480 Ⅱ熒光定量PCR儀，美國(guó)Molecular devices公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酸菌株的分離

稱取10 g酒醅樣品，與90 mL無(wú)菌生理鹽水(9 g/L NaCl)混勻，梯度稀釋后取10-2、10-3、10-4梯度稀釋液分別涂布于乳酸菌篩選培養(yǎng)基、醋酸菌篩選培養(yǎng)基和其他產(chǎn)酸細(xì)菌篩選培養(yǎng)基。芽孢桿菌的分離采用將酒醅與生理鹽水的混合物在85 °C水浴處理30 min，梯度稀釋后選擇10-2、10-3、10-4梯度稀釋液涂布于上述篩選培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基平板分別以需氧(靜置培養(yǎng))和厭氧(厭氧箱培養(yǎng))2種方式在37 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑選有明顯透明圈的單菌落進(jìn)行分離純化、鑒定和保藏。

1.3.2 產(chǎn)酸細(xì)菌屬水平鑒定

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取上述篩選菌株基因組，利用16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)菌株基因組進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[18]，確定菌株所屬微生物屬。

1.3.3 酒醅中細(xì)菌的絕對(duì)數(shù)量測(cè)定

酒醅中微生物宏基因組DNA制備采用液氮研磨結(jié)合試劑盒抽提的方法[19]。稱取5 g酒醅樣品至研缽中，加入液氮充分研磨使細(xì)胞破碎。使用PowerMax?Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取微生物宏基因組DNA，提取步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。提取得到的基因組DNA用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行基因組濃度和純度的檢測(cè)，合格樣品于-20 ℃冰箱保存。

對(duì)酒醅中產(chǎn)酸微生物的絕對(duì)定量分析采用各菌屬的16S rDNA特異性引物[20-21](表1)，利用熒光定量PCR對(duì)白酒窖內(nèi)發(fā)酵酒醅中Bacillus、Lactobacillus、Lactococcus、Weissella、Acetobacter和Pediococcus等菌屬的微生物進(jìn)行定量。將各菌屬16S rDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物連接至PUC57載體，構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算參考文獻(xiàn)[19]。根據(jù)擴(kuò)增曲線，以閾值循環(huán)數(shù)Ct(即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各微生物的生物量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用25 μL反應(yīng)體系：DNA模板10 ng，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，SYBR?PremixEx TaqTMⅡ 12.5 μL，使用無(wú)菌水補(bǔ)足體系。定量PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，58 ℃退火 30 s，65 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primers used for RT-PCR

1.3.4 菌株產(chǎn)酸能力分析

將菌株在糧食浸出培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)72 h后(醋桿菌培養(yǎng)添加30 g/L無(wú)水乙醇，靜置培養(yǎng)，其余微生物厭氧培養(yǎng))，8 000 r/min離心20 min后取上清液，用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾，利用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量。

依據(jù)洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程溫度(22～32 ℃)、酒醅中乙醇含量(小于70 g/L)和初始pH值(小于7.0)的變化特點(diǎn)[22-23]，確定考察窖內(nèi)發(fā)酵環(huán)境因素對(duì)菌株產(chǎn)酸能力影響的條件為：溫度選擇22、27、32、37 ℃；乙醇含量考察0、10、30、50、70 g/L 5個(gè)梯度；培養(yǎng)基初始pH值考察3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將菌株接種至糧食浸出培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后(醋桿菌在有氧、加入30 g/L無(wú)水乙醇條件下培養(yǎng)，其他微生物進(jìn)行厭氧培養(yǎng))，檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸含量。

有機(jī)酸含量的測(cè)定：處理后的樣品用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。液相色譜檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，在210 nm波長(zhǎng)處，色譜柱為HPLC organic acid analysis column(300 mm×7.8 mm)，檢測(cè)條件參照文獻(xiàn)[24]。以乳酸和乙酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算有機(jī)酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)產(chǎn)酸微生物生物量與乳酸、乙酸含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，|r|>0.7且p<0.05代表高度顯著性相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅中產(chǎn)酸菌株的分離與鑒定

利用產(chǎn)酸菌株可溶解CaCO3的選擇性分離培養(yǎng)方法從洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵不同時(shí)期的酒醅中分離得到163株有明顯透明圈的菌株。通過(guò)對(duì)分離菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，依據(jù)《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[25]對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定，選擇代表不同菌落形態(tài)的菌株用于菌種鑒定和后續(xù)研究。分離獲得的細(xì)菌菌株，進(jìn)一步鑒定，通過(guò)測(cè)定其16S rRNA基因序列，并將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，當(dāng)16S rRNA基因序列相似度≥99%時(shí)可認(rèn)定為1個(gè)種[26]。最終從酒醅中分離得到的12株產(chǎn)酸菌株(16S rRNA基因序列相似度均≥99%)，分別屬于6個(gè)屬12個(gè)種，包括戊糖足球菌(Pediococcuspentosaceus)JP1、嗜酸乳酸足球菌(Pediococcusacidilactici)JP2、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JP3、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)JP4、陰道乳桿菌(Lactobacillusvaginalis)JP5、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)JP6、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)JP7、食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)JP8、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)JP9、巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)JP10、東方醋桿菌(Acetobacterorientalis)JP11和蘋果醋桿菌(Acetobactermalorum)JP12，如圖1所示。

2.2 菌株產(chǎn)有機(jī)酸能力分析

圖1 分離自濃香型白酒酒醅細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial strains isolated from fermented grains for producing Chinese strong-aroma spirit 注：以細(xì)菌16S rRNA基因構(gòu)建進(jìn)化樹，分支點(diǎn)數(shù)值表示置信度，比例尺表示堿基替換率，0.02表示2%的序列差異；括號(hào)內(nèi)序號(hào)表 示與測(cè)序結(jié)果最相近的GenBank登錄號(hào)。

從酒醅中分離得到的12株細(xì)菌在糧食浸出培養(yǎng)基中分別進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵(醋桿菌進(jìn)行有氧培養(yǎng)，其他細(xì)菌進(jìn)行厭氧培養(yǎng))。由圖2可以看出，在相應(yīng)培養(yǎng)條件下，醋桿菌只產(chǎn)乙酸，乳酸菌和芽孢桿菌只產(chǎn)乳酸。醋桿菌中A.pasteurianusJP10可以合成4.40 g/L乙酸，其產(chǎn)乙酸能力分別是A.orientalisJP11及AcetobactermalorumJP12的1.79倍和2.20倍。產(chǎn)乳酸的菌株中L.plantarumJP3生成乳酸能力最強(qiáng)，達(dá)到8.59 g/L；P.acidilacticiJP2、L.pentosusJP4、B.amyloliquefaciensJP6、W.cibariaJP8和Lat.garvieaeJP9合成乳酸能力次之(5.22～7.31 g/L)；P.pentosaceusJP1、L.vaginalisJP5和B.cereusJP7合成乳酸水平相對(duì)較低。

圖2 分離自酒醅的菌株產(chǎn)有機(jī)酸能力Fig.2 The ability of strains isolated from fermented qrains to produce organic acids

2.3 濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程酒醅中產(chǎn)酸微生物的定量分析

白酒窖內(nèi)發(fā)酵是微生物群體參與的發(fā)酵過(guò)程，有機(jī)酸的合成和積累水平與具有該能力菌株的數(shù)量和可調(diào)控有機(jī)酸合成代謝途徑的環(huán)境因素密切相關(guān)。因此，建立所分離菌株與洋河濃香型白酒中乳酸和乙酸合成之間的明確關(guān)系，需要在分析菌株合成有機(jī)酸能力的基礎(chǔ)上，解析窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸菌株數(shù)量變化與有機(jī)酸合成之間的相關(guān)性，并闡明白酒窖內(nèi)發(fā)酵工藝條件對(duì)菌株合成有機(jī)酸水平的影響。

依據(jù)從洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程酒醅中分離得到的產(chǎn)酸細(xì)菌菌屬，通過(guò)qRT-PCR對(duì)6個(gè)菌屬的絕對(duì)數(shù)量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中Lactobacillus(106～109copies/g)和Bacillus(106～108copies/g)是數(shù)目最多的兩類細(xì)菌。Lactobacillus數(shù)量在窖內(nèi)發(fā)酵0～20 d增加了2個(gè)數(shù)量級(jí)，最高為3.9×109copies/g，21～60 d數(shù)量逐漸減少，發(fā)酵結(jié)束時(shí)Bacillus和Lactobacillus數(shù)量與起始數(shù)量接近。Bacillus數(shù)量在0～15 d增加了1個(gè)數(shù)量級(jí)，15 d后數(shù)量逐漸減少，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)下降了1個(gè)數(shù)量級(jí)。Weissella生物量在發(fā)酵0～3 d增加了1個(gè)數(shù)量級(jí)，3～60 d其數(shù)目減少了2個(gè)數(shù)量級(jí)。Acetobacter數(shù)量在發(fā)酵0～6 d，增加了1個(gè)數(shù)量級(jí), 6～60 d數(shù)量減少了3個(gè)數(shù)量級(jí)。Lactococcus和Pediococcus數(shù)量在白酒窖內(nèi)發(fā)酵整個(gè)階段均無(wú)明顯變化，分別在105～106copies/g和104～105copies/g。

圖3 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程酒醅中產(chǎn)酸細(xì)菌數(shù)量變化Fig.3 Quantification of bacteria in fermented grains during Chinese strong-aroma spirit fermentation

2.4 白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程酒醅中產(chǎn)酸細(xì)菌與有機(jī)酸合成的相關(guān)性分析

在前期研究中，對(duì)洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程相同酒醅中乳酸和乙酸含量變化的分析已證實(shí)：窖內(nèi)發(fā)酵前期酒醅中乳酸和乙酸含量明顯降低，出窖60 d時(shí)乳酸和乙酸含量分別比入窖時(shí)增加了18.8%和60.4%；同時(shí)根據(jù)酒醅屬水平優(yōu)勢(shì)微生物組成差異，酒醅樣品被明顯區(qū)分為0～15 d和15～60 d兩個(gè)階段[27]。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合本研究結(jié)果，利用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)酒醅產(chǎn)酸微生物生物量與白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中乙酸、乳酸含量進(jìn)行了相關(guān)性分析。由圖4-A可知，洋河濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵0～15 d，乳酸合成與Weissella、Bacillus、Lactobacillus和Pediococcus4個(gè)菌屬的總量呈高度顯著正相關(guān)(r=0.923，p<0.05)，其中Weissella(r=0.975，p<0.05)是與乳酸正相關(guān)性最好的微生物；乙酸的生成則與Acetobacter，Bacillus和Weissella3個(gè)屬的總生物量呈高度顯著正相關(guān)(r=0.852，p<0.05)，其中Acetobacter與乙酸的正相關(guān)性最好(r=0.976,p<0.05)。窖內(nèi)發(fā)酵15～60 d，乙酸與Lactococcus、Weissella、Bacillus和Lactobacillus4個(gè)屬的總生物量呈高度顯著正相關(guān)(r=0.801，p<0.05)；Lactobacillus是與乳酸合成高度顯著正相關(guān)(r=0.741，p<0.05)的菌屬(圖4-B)。上述分析表明，分離自洋河濃香型白酒酒醅的6個(gè)菌屬均與白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程酒醅中乙酸和乳酸的生成呈正相關(guān)。

A-白酒窖內(nèi)發(fā)酵0～15 d；B-白酒窖內(nèi)發(fā)酵15～60 d圖4 產(chǎn)酸細(xì)菌與酒醅中有機(jī)酸合成的相關(guān)性分析Fig.4 The correlation analysis between organic acids producing-bacteria in fermented grains and organic acids biosynthesis 注：箭頭上方所標(biāo)數(shù)值大于0.7時(shí)，表示兩者具有高度正相關(guān)性，數(shù)值越接近 1.0表示兩者相關(guān)性越好；*表示p <0.05。

2.5 環(huán)境因素對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響

濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中窖內(nèi)環(huán)境的變化對(duì)微生物代謝合成有機(jī)酸的能力有顯著影響[28]。為了分析分離菌株在白酒工藝條件改變時(shí)產(chǎn)酸能力變化，該研究考察了白酒發(fā)酵過(guò)程中的主要影響參數(shù)如溫度、乙醇含量和培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響。根據(jù)菌株產(chǎn)單一有機(jī)酸能力強(qiáng)弱和微生物屬種關(guān)系，選擇了產(chǎn)乙酸能力最強(qiáng)的醋桿菌(A.pasteurianusJP10)以及產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)的乳酸菌(P.acidilacticiJP2、L.plantarumJP3、W.cibariaJP8、Lat.garvieaeJP9)和芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) JP6這6種菌株進(jìn)行產(chǎn)酸性能的研究。

溫度對(duì)乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸能力的影響較小，對(duì)A.pasteurianusJP10產(chǎn)乙酸能力的影響較為顯著(圖5)。

圖5溫度對(duì)菌株產(chǎn)有機(jī)酸的影響Fig.5 Effect of temperature on producing organic acids by fermented grains isolates

在22 ℃靜置培養(yǎng)條件下A.pasteurianusJP10產(chǎn)乙酸能力為0.45 g/L，37 ℃時(shí)產(chǎn)乙酸量最多，是22 ℃下的4.96倍。

隨著白酒窖內(nèi)發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅中乙醇含量逐漸增加，對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝均有不同程度的影響[29]。如圖6所示，在培養(yǎng)基中添加0～70 g/L乙醇并在厭氧條件下培養(yǎng)對(duì)P.acidilacticiJP2、L.plantarumJP3和B.amyloliquefaciensJP6產(chǎn)乳酸能力沒(méi)有顯著影響。0～30 g/L乙醇條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)W.cibariaJP8產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)(2.79～2.96 g/L)，乙醇添加量為70 g/L時(shí)產(chǎn)乳酸能力最弱(1.45 g/L)，相比10 g/L乙醇含量時(shí)降低了51.0%。Lat.garvieaeJP9產(chǎn)乳酸能力在10～30 g/L乙醇時(shí)較高(2.94～3.29 g/L)，50 g/L乙醇時(shí)產(chǎn)乳酸含量迅速下降，相比30 g/L降低了54.6%。有氧條件下，醋桿菌可將乙醇氧化生成乙酸，因此適當(dāng)?shù)囊掖己繉?duì)乙酸生成有促進(jìn)作用[30]。無(wú)乙醇靜置培養(yǎng)時(shí)，A.pasteurianusJP10沒(méi)有產(chǎn)生乙酸的能力，乙醇含量為50 g/L時(shí)乙酸含量最高(1.75 g/L)，是10 g/L的1.67倍。

圖6 乙醇對(duì)菌株產(chǎn)有機(jī)酸的影響Fig.6 Effect of ethanol on producing organic acids by fermented grains isolates

從圖7可知，在培養(yǎng)基初始pH 3.0下厭氧培養(yǎng)時(shí)，乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸含量均低于1 g/L，而培養(yǎng)基初始pH值的提高有助于乳酸的合成。其中，L.plantarumJP3產(chǎn)乳酸含量在培養(yǎng)基初始pH為6.0時(shí)達(dá)到最高(8.60 g/L)，其余菌株產(chǎn)乳酸能力在pH 7.0時(shí)最強(qiáng)。在培養(yǎng)基初始pH為3.0～4.0條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)時(shí)，A.pasteurianusJP10產(chǎn)乙酸能力為0.72～0.76 g/L，培養(yǎng)基初始pH 6.0時(shí)該菌株產(chǎn)乙酸含量達(dá)到最高值(1.40 g/L)，是pH 3.0下乙酸產(chǎn)量的1.94倍。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響Fig.7 Effect of initial pH of cultivation medium on producing of organic acids by fermented grains isolates

3 結(jié)論與討論

濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中，酒醅細(xì)菌微生物是乙酸和乳酸的主要產(chǎn)生者。乙酸和乳酸作為白酒中的主要有機(jī)酸，是乙酸乙酯和乳酸乙酯的重要前體，且乙酸在己酸菌和丁酸菌作用下，能與乙醇等轉(zhuǎn)化生成己酸和丁酸[31-33]。因此，明確酒醅微生物與乳酸、乙酸等有機(jī)酸合成的相互關(guān)系，能有效維持白酒風(fēng)味的平衡。

本研究利用3種篩選培養(yǎng)基從濃香型白酒酒醅中得到6個(gè)屬產(chǎn)酸微生物，分別為L(zhǎng)actobacillus、Lactococcus、Weissella、Bacillus、Acetobacter和Pediococcus。這與栗連會(huì)等從濃香型白酒酒醅中分離得到Lactobacillus、Pediococcus、Bacillus等產(chǎn)酸微生物和孫鵬飛等從白酒酒醅中分離得到Bacillus、Acetobacter、Weissella等產(chǎn)酸微生物的結(jié)論基本一致[34-35]。進(jìn)一步通過(guò)高效液相色譜和qRT-PCR分別對(duì)12種菌株產(chǎn)有機(jī)酸能力和6個(gè)屬的產(chǎn)酸細(xì)菌進(jìn)行了絕對(duì)定量分析，并對(duì)白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程酒醅產(chǎn)酸微生物生物量與乳酸、乙酸含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)白酒發(fā)酵0～15 d時(shí)，乙酸、乳酸均與多種產(chǎn)酸微生物總量呈高度顯著正相關(guān)，同時(shí)乙酸與Acetobacter、乳酸與Weissella均呈高度顯著正相關(guān)。發(fā)酵15～60 d時(shí)，乳酸合成僅與Lactobacillus呈高度顯著正相關(guān)，乙酸僅與4個(gè)屬微生物總量呈高度顯著正相關(guān)。說(shuō)明由于濃香型白酒發(fā)酵前期細(xì)菌優(yōu)勢(shì)微生物種類較豐富，乙酸和乳酸的合成受多種微生物的共同影響，且Acetobacter和Weissella是該階段影響乙酸和乳酸含量的主導(dǎo)微生物。同時(shí)，濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵中后期Lactobacillus生物量在產(chǎn)酸微生物中占有優(yōu)勢(shì)地位，乳酸合成僅與Lactobacillus呈高度顯著正相關(guān)關(guān)系是導(dǎo)致濃香型白酒實(shí)際生產(chǎn)中乳酸及乳酸乙酯含量居高不下的主要原因。過(guò)量的乳酸會(huì)對(duì)窖池環(huán)境造成破壞，導(dǎo)致窖池板結(jié)和退化。乳酸乙酯含量過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致酒體單調(diào)，影響白酒風(fēng)味平衡[34,36]。通過(guò)考察白酒窖內(nèi)發(fā)酵的3個(gè)重要參數(shù)(溫度、乙醇含量和初始pH)與分離菌株產(chǎn)酸性能的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，溫度、乙醇含量和初始pH的變化均對(duì)醋酸菌產(chǎn)乙酸能力有顯著影響。溫度對(duì)乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸無(wú)明顯影響，乙醇含量與部分乳酸菌產(chǎn)乳酸能力有關(guān)，初始pH變化則對(duì)所有分離菌株產(chǎn)乳酸能力均有顯著作用：較低初始pH抑制菌株產(chǎn)酸能力，初始pH 6.0～7.0時(shí)菌株產(chǎn)乳酸能力明顯提高。因此，初始pH是影響乳酸菌和芽孢桿菌產(chǎn)乳酸的主要環(huán)境因素。通過(guò)調(diào)節(jié)入窖時(shí)的初始pH值，對(duì)合理調(diào)控白酒乳酸含量，實(shí)現(xiàn)濃香型白酒“增己降乳”具有重要意義。

綜上所述，通過(guò)微生物分離技術(shù)、qRT-PCR及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段的有機(jī)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)可培養(yǎng)微生物在白酒復(fù)雜釀造環(huán)境中代謝功能的全面分析，為闡明白酒產(chǎn)酸機(jī)理和提升白酒品質(zhì)提供借鑒。然而，白酒窖內(nèi)發(fā)酵15～60 d，酒醅微生物與Lactococcus、Weissella、Bacillus和Lactobacillus的總量呈高度顯著正相關(guān)，表明這4個(gè)屬的部分菌株具有明顯產(chǎn)生乙酸的能力，但由于篩選條件的局限性，在白酒釀造中后期并未成功分離到高產(chǎn)乙酸的菌株。今后可利用高通量篩選和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對(duì)濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中微生物與有機(jī)酸合成的相互關(guān)系進(jìn)行更加深入、系統(tǒng)的研究。