任聰，辜楊，杜海，徐巖,2,3*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀酒科學(xué)與酶技術(shù)研究中心，江蘇 無(wú)錫，214112) 2(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214112) 3(江南大學(xué)，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122)

濃香型白酒是中國(guó)三大基本香型白酒(濃香型、清香型和醬香型)之一，其釀造特征被總結(jié)為“千年老窖萬(wàn)年糟”“以窖養(yǎng)糟,以糟養(yǎng)泥”等俗語(yǔ)，這些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)是古人釀造智慧的集中體現(xiàn)。生產(chǎn)上歷來(lái)對(duì)窖泥品質(zhì)給予了高度的關(guān)注，尤其重視以己酸菌(產(chǎn)己酸細(xì)菌的統(tǒng)稱)為代表的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的細(xì)菌。近年來(lái)，隨著微生物生態(tài)學(xué)與微生物組學(xué)的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)手段的發(fā)展使窖泥中蘊(yùn)含的厭氧微生物科學(xué)奧秘能逐步得以剖析。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的混合循環(huán)發(fā)酵，優(yōu)質(zhì)老窖泥中富集了200種以上的厭氧微生物，這些微生物之間及與環(huán)境因子的相互作用，形成了復(fù)雜的窖泥微生物生態(tài)系統(tǒng)[1]。窖泥中的微生物多為嚴(yán)格厭氧和兼性厭氧的細(xì)菌和嚴(yán)格厭氧的古菌組成，這些微生物對(duì)濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)形成具有非常重要的貢獻(xiàn)，并且相互作用維持著濃香型白酒釀造窖泥微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定[2-3]。己酸乙酯在濃香型白酒中，是除乙醇外的最高豐度的風(fēng)味物質(zhì)，其前體己酸由己酸菌合成。由于釀造體系中乙醇豐度較高，己酸乙酯的合成效率往往與發(fā)酵過(guò)程中己酸的累積濃度呈正相關(guān)。更為重要的是，窖泥中己酸菌的豐度及其正常代謝活動(dòng)是窖泥微生物穩(wěn)態(tài)的指示菌[4]，故己酸菌在濃香型白酒釀造中有著獨(dú)特的作用和重要的地位。

自然界能產(chǎn)生己酸的微生物種類并不多，目前已報(bào)道的能以較高效率合成己酸的純培養(yǎng)己酸菌主要有克氏梭菌、瘤胃菌CBP6、埃氏巨球型菌、半乳糖己酸菌等6種細(xì)菌，其中克氏梭菌、瘤胃菌CBP6、埃氏巨球型菌具有較高的己酸產(chǎn)量和合成強(qiáng)度(表1)。

微生物合成己酸主要通過(guò)β-氧化循環(huán)的反轉(zhuǎn)途徑進(jìn)行，合成己酸的胞內(nèi)核心生化反應(yīng)是以乙酰輔酶A為起始合成及碳鏈延伸單元，每次碳鏈延伸將脂肪鏈延長(zhǎng)2個(gè)碳單元[5]。目前報(bào)道的多種己酸合成微生物除可以合成主要產(chǎn)物己酸外，還可以合成少量的丁酸、戊酸、庚酸、辛酸等多種類型的短中鏈脂肪酸，利用己酸菌合成中鏈脂肪酸已成為當(dāng)前中鏈脂肪酸研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[6-7]。

我國(guó)科研工作者對(duì)白酒釀造體系中己酸菌的分離與鑒定始于20世紀(jì)60年代，多以乙醇和乙酸鹽作為碳源，進(jìn)行己酸菌的富集及分離[14-15]。半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，釀酒科研工作者不斷致力于己酸菌的分離與應(yīng)用，推動(dòng)了人工窖泥技術(shù)的建立與廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，對(duì)窖泥己酸菌類型又有了新的認(rèn)識(shí)，如新分離得到的瘤胃菌CBP6菌株，該菌株利用的主要碳源為乳酸，而非乙醇，該發(fā)現(xiàn)刷新了人們對(duì)窖泥己酸菌種類的認(rèn)識(shí)，對(duì)窖泥中己酸菌類型進(jìn)行了重要的補(bǔ)充[16]。然而，窖泥中的主體己酸菌為何種己酸菌，是乙醇營(yíng)養(yǎng)型為主，還是乳酸營(yíng)養(yǎng)型為主？至今對(duì)該問(wèn)題也鮮有研究。

表1 已報(bào)道的己酸合成菌株(純培養(yǎng)菌株)Table 1 Reported caproate-producing strains (pure culture)

該文以同一廠區(qū)不同建窖時(shí)間的新窖與老窖為研究對(duì)象，比較新窖和老窖的窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)與發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)變化情況，以及兩者的相關(guān)性，進(jìn)而推斷窖泥中的主體己酸菌類型。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)選取新、老窖池各6口，出池時(shí)取黃水樣品，同時(shí)采用五點(diǎn)取樣法取窖泥50 g并混合均勻。黃水與窖泥樣品均凍存于-20 ℃待用。本研究中的老窖池窖齡為20年，新窖池窖齡為1年。

1.2 主要試劑

叔戊酸、叔戊醇、乙醚購(gòu)買于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；作為標(biāo)品的己酸乙酯、丁酸乙酯、己酸和丁酸購(gòu)買自美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；窖泥DNA提取用試劑盒(DNeasy Power Soil Kit)購(gòu)買于美國(guó)Qiagen公司。

1.3 黃水樣品的處理方法

黃水樣品處理方法為：取1 mL黃水于12 000 r/min條件下離心2 min，之后取200 μL離心上清液，加入50 μL內(nèi)標(biāo)(經(jīng)5%的濃鹽酸酸化，濃度為12.5 g/L的叔戊酸，pH2.5)，再加入250 μL乙醚進(jìn)行萃取，利用振蕩器渦旋振蕩30 s，之后于10 000 r/min條件下離心5 min，吸取上層有機(jī)相150 μL進(jìn)行氣相色譜分析。

1.4 氣相色譜分析

色譜柱為Agilent CP-Wax 57 CB。升溫程序：60 ℃，保持0.5 min；以20 ℃ /min的速度升溫至190 ℃，保持4.5 min；分流比30∶1；進(jìn)樣口溫度220 ℃；氫火焰離子檢測(cè)器(FID)溫度220 ℃。

1.5 窖泥微生物DNA的提取

窖泥微生物總基因組DNA利用DNeasy PowerSoil Kit進(jìn)行提取，提取方法按照試劑公司提供的實(shí)驗(yàn)操作指南進(jìn)行。利用瓊脂糖電泳對(duì)提取的窖泥微生物DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格后進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序。

1.6 高通量測(cè)序

建庫(kù)與測(cè)序在上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序的引物為338F (5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3’)與806R(5’- GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3’)，擴(kuò)增的為16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq。

2 結(jié)果與分析

2.1 新、老窖池酒醅發(fā)酵終點(diǎn)短中鏈脂肪酸的含量比較

新老窖池采用相同的釀造工藝，發(fā)酵時(shí)間均為60 d，在出窖時(shí)取黃水進(jìn)行檢測(cè)。氣相色譜分析表明，老窖池黃水中己酸含量為2 506 mg/L，而新窖池黃水的己酸含量?jī)H為95 mg/L，老窖池的己酸含量為新窖池的26倍，兩者差異極其顯著(圖1)。

圖1 新窖與老窖出池黃水中的己酸與丁酸含量Fig.1 Concentrations of caproate and butyrate in yellow water of new and aged pit

對(duì)于黃水中的丁酸而言，老窖池平均含量為1 069 mg/L，新窖池為410 mg/L，老窖池為新窖池的2.6倍(圖1)。通過(guò)檢測(cè)黃水中的己酸和丁酸可以看出，對(duì)于己酸產(chǎn)生能力而言，老窖池遠(yuǎn)高于新窖池；而對(duì)于丁酸而言，雖然老窖池的丁酸仍然高于新窖池，但差異倍數(shù)小于己酸在新、老窖池黃水中的差異倍數(shù)。己酸/丁酸比值分析表明，老窖池的己酸/丁酸比值平均為2.4，而新窖池則低至0.2?？梢姡辖殉鼐哂懈弋a(chǎn)己酸的能力，新窖池的丁酸產(chǎn)生能力高于己酸產(chǎn)生能力。

2.2 新、老窖泥菌群結(jié)構(gòu)分析

對(duì)老窖池與新窖池的窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，本研究集中于細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的分析。16S rRNA基因測(cè)序表明，從綱水平而言，新窖泥中細(xì)菌類型主要為芽孢桿菌綱(74%)和梭菌綱(22%)，兩類微生物合計(jì)96%，芽孢桿菌綱微生物豐度為梭菌綱微生物豐度的近3.3倍；而對(duì)于老窖泥而言，芽孢桿菌綱微生物豐度極低(小于0.1%)，主體構(gòu)成微生物為梭菌綱(80%)和擬桿菌綱(15%)(圖2)。

A-綱水平；B-屬水平；New表示新窖泥，Aged表示老窖泥，每種窖泥做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別以-1、-2和-3表示圖2 在(A)鋼水平和(B)屬水平上老窖泥與新窖泥的微生物組成結(jié)構(gòu)Fig.2 The microbial community profiling in new- and aged- pit mud at class level (A) and genus level (B)

就屬水平而言，新窖泥中豐度最高的屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)，該屬在老窖泥中出現(xiàn)的豐度極低(低于0.1%)；而老窖泥中豐度最高的屬為己酸菌屬(Caproicproducens)(圖2，圖3)。己酸菌屬的代表種為韓國(guó)研究人員于2015年發(fā)表的半乳糖己酸菌(Caproiciproducensgalactitolivorans)，該菌在白酒釀造體系中未見。雖然己酸菌屬微生物在3個(gè)典型老窖泥中豐度顯示不盡相同(27%～84%)，但可以確定的是，該屬微生物為老窖泥中的第一高豐度屬。老窖泥中豐度遠(yuǎn)高于新窖泥的其他微生物還有Petrimonas(0.7%～24%)，norank_f_Clostridiaceae_1(6%～16%)，Aminobacterium(0.1%～5%)和Proteiniphilum(1%～4%)4個(gè)屬；而新窖泥中高于老窖泥的屬為Hydrogenispora(3%～8%)，Bacillus(2%～7%)，Clostridium_sensu_stricto_12(0.4%～4%)和Bacillus(2%～7%)3個(gè)屬(圖3)。因此，從屬水平分析來(lái)看，老窖泥中高豐度屬排序?yàn)榧核峋鷮?Caproicproducens)>Petrimonas(大致與norank_f_Clostridiaceae_1相當(dāng))>Aminobacterium>Proteiniphilum。

2.3 窖泥高豐度微生物與風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的相關(guān)性分析

上述分析比較了新、老窖泥細(xì)菌在綱水平和屬水平的差異，尋找出了老窖泥和新窖泥中豐度分別較高的屬，那么這些屬的微生物是否與發(fā)酵過(guò)程中己酸和丁酸生成相關(guān)？為從代謝產(chǎn)物與微生物豐度相關(guān)性探索可能產(chǎn)生己酸和丁酸的屬，我們進(jìn)行了典型相關(guān)性分析(canonical correlation analysis，CCA)。結(jié)果表明，在老窖泥中豐度較高的5個(gè)屬(Caproicproducens，Petrimonas，norank_f_Clostridiaceae_1，Aminobacterium，Proteiniphilum)與己酸和丁酸生成密切相關(guān)(圖4)。因此，推測(cè)主要的己酸和丁酸合成微生物可能存在于這5個(gè)屬的微生物種中。

New表示新窖泥，Aged表示老窖泥，每種窖泥做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別以-1、-2和-3表示圖3 窖泥中微生物與樣品對(duì)應(yīng)關(guān)系Fig.3 Correlation of microbes at genus level in pit muds and their source samples

圖4 窖泥微生物與發(fā)酵中風(fēng)味物質(zhì)(己酸和丁酸) 相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between microbes in pit mud and flavor components 注：本圖展示了微生物種類、樣本與代謝產(chǎn)物(己酸、丁酸) 三者的對(duì)應(yīng)關(guān)系

2.4 新、老窖泥差異物種的進(jìn)化分析和窖泥中主體己酸菌的判定

為進(jìn)一步分析新、老窖泥差異物種與己酸及丁酸合成相關(guān)的微生物種，尤其是己酸合成微生物，我們對(duì)主要差異物種進(jìn)行了進(jìn)化分析。分析表明，己酸菌屬中可能存在著3種己酸菌(圖5，含Caproicproducens的3個(gè)分支)。我們將3種己酸菌的代表OTU(operational taxonomic units，操作分類單元，即測(cè)序中代表某種微生物的16S rRNA基因片段序列)及測(cè)出的己酸菌OTU與目前已經(jīng)報(bào)道的主要己酸菌進(jìn)行相似性與進(jìn)化分析比較(圖6)，同時(shí)將各OTU的相對(duì)豐度進(jìn)行了標(biāo)注(圖7)。結(jié)果表明，兩個(gè)OTU(OTU548和OTU555)的豐度占所有己酸菌屬OTU的90.7%。其中，OTU548與瘤胃菌CBP6菌株的序列同一性(identity)為99%(圖6)，因此，我們認(rèn)為OTU548所代表的己酸菌種為與瘤胃菌CBP6同一類型的己酸菌種，該種在本研究老窖泥中的豐度為6%～75%。OTU555在老窖泥中的豐度為3%～27%，但至今尚未有OTU555代表的菌株被分離出來(lái)。OTU451代表的己酸菌屬微生物種，雖然在老窖泥中豐度較低(最高為0.76%)，但其代表的己酸菌屬非常具有代表意義，其與已經(jīng)分離得到的RuminococcaceaebacteriumCPC11菌株的16S rRNA序列同一性為99%(圖6)，因此我們認(rèn)為OTU451代表的菌株與RuminococcaceaebacteriumCPC11為同一個(gè)種，且該菌與韓國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)并命名的半乳糖己酸菌在進(jìn)化上親緣關(guān)系最為接近(圖7)。同時(shí)，我們還比較了傳統(tǒng)己酸菌克氏梭菌在本研究樣本中的豐度，其代表OTU376的豐度僅為0.12%。

圖5 新老窖泥中高豐度物種在種水平的分布情況Fig.5 The phylogenetic tree of abundant species at species level in new and old pit mud

圖6 窖泥中己酸菌代表16S rRNA基因(338-806nt)OTU 與已分離典型己酸菌的序列相似性比對(duì)Fig.6 Simility analysis for 16S rRNA gene (338-806nt) of caproate-producing bacteria OTU in pit mud and several typical caproate-producing bacteria 注：比對(duì)區(qū)域?yàn)?6S rRNA基因的338～806區(qū)域; 幾種已分離鑒定己酸菌16S rRNA基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)分別為Ruminococcaceae Sp CBP6(KM454167)，Ruminococcaceae Sp CPC11 (KM454168)和Caproiciproducens galactitolivorans(FJ805840)，Clostridium kluyveri(NR_074165)和 Megasphaera elsdeni(NR_102980).

通過(guò)對(duì)己酸菌屬下所有代表OTU的分析，我們得出以下結(jié)論：(1)窖泥中至少具有4種類型己酸菌，其中3種為己酸菌屬微生物，在本研究中的代表OTU豐度排序?yàn)镺TU548(CBP6相同種)>OTU555(未被分離鑒定)>OTU451(CPC11相同種)；(2)OTU548和OTU451的代表種分別為瘤胃菌CBP6與瘤胃菌CPC11，兩者均以乳酸作為主要碳源，主要代謝產(chǎn)物為己酸，CPC11還能合成一定量的丁酸；(3)OTU555代表的己酸菌雖然至今未能分離得到，根據(jù)進(jìn)化分析，該種微生物可能仍然為產(chǎn)己酸微生物；(4)克氏梭菌在傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中雖然被認(rèn)為是窖泥中的重要己酸菌，在本研究所用窖泥中也具有一定的豐度(約等于0.12%)，我們推測(cè)該菌并非本研究窖泥中的主體己酸菌。本研究中的主體己酸菌是以己酸菌Caproicproducenssp.316菌株(形態(tài)見本期封面圖，與文獻(xiàn)已報(bào)道的CBP6同種)和OTU555為代表的己酸菌。

圖7 新老窖泥中己酸菌OTU與已知己酸菌的 進(jìn)化關(guān)系分析Fig.7 The phylogenic tree analysis of OTU of caproate- producing bacteria in pit muds and known carpoate-producing bacteria 注：OUT旁的柱狀色塊表示該OTU在新、 老窖泥中的相對(duì)豐度

3 討論與結(jié)論

人們?cè)缇驼J(rèn)識(shí)到窖泥厭氧菌在濃香型白酒釀造中的重要作用，并試圖解析窖泥微生物的結(jié)構(gòu)組成，認(rèn)識(shí)窖泥微生物的功能。但目前對(duì)于濃香型白酒窖泥微生物群落的研究多以差異性研究為主，如選取全國(guó)各地區(qū)酒廠、不同年份窖池以及窖池不同部位的窖泥樣品，對(duì)窖泥樣品中的微生物群落進(jìn)行比較與分析，得到不同地區(qū)、不同窖齡、不同質(zhì)量的窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)。陶勇等通過(guò)擴(kuò)增子測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)老窖泥中富含梭菌綱的微生物[9]；胡曉龍等則比較了相同窖齡但窖泥質(zhì)量不同的窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)梭菌綱微生物在優(yōu)質(zhì)窖泥中豐度更高，而在退化窖泥中豐度極低[4]。以上研究均表明梭菌綱微生物是濃香型窖泥發(fā)揮正常釀造功能所必需的微生物，也明確了己酸菌是梭菌綱下的微生物，但分析多停留在綱水平至屬水平，而對(duì)于己酸菌在種水平上的區(qū)分仍然鮮有研究。本研究將新、老窖泥的微生物菌群結(jié)構(gòu)組成與代謝產(chǎn)物(己酸、丁酸)豐度進(jìn)行對(duì)比分析，認(rèn)識(shí)到老窖泥中己酸菌類型的獨(dú)特性與復(fù)雜性。

目前對(duì)于白酒釀造體系中的己酸菌認(rèn)識(shí)逐步清晰，不同于西方蒸餾酒己酸來(lái)源于酵母的特征，我國(guó)基于泥窖發(fā)酵體系中的己酸菌主要來(lái)源于窖泥。從營(yíng)養(yǎng)型角度而言，目前發(fā)現(xiàn)的己酸菌類型包括乙醇營(yíng)養(yǎng)型，如克氏梭菌；乳酸營(yíng)養(yǎng)型，如己酸菌屬下的己酸菌菌株(已經(jīng)分離鑒定的是CBP6菌株代表的種與CPC11菌株代表的種)[16]。研究表明，窖泥中的主體己酸菌為己酸菌屬微生物，而非傳統(tǒng)使用的乙醇營(yíng)養(yǎng)型己酸菌(如克氏梭菌)。

近年來(lái)隨著極端高溫天氣的頻繁出現(xiàn)，乳酸菌與乙酸菌的繁殖更難以被控制，乙酸乙酯與乳酸乙酯超標(biāo)已經(jīng)成為困擾釀酒行業(yè)的共性問(wèn)題。乳酸乙酯和乙酸乙酯在酒體中含量超標(biāo)，與己酸乙酯的量比關(guān)系倒掛，導(dǎo)致成品酒酒體單薄、口感較澀，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。從微生物學(xué)生態(tài)學(xué)角度而言，窖泥菌群結(jié)構(gòu)紊亂可能是造成酯類不協(xié)調(diào)的重要原因，窖泥菌群結(jié)構(gòu)紊亂將引起己酸菌豐度失調(diào)，最終引起酒體酯類比例失衡。因此，認(rèn)識(shí)己酸菌的種類對(duì)于構(gòu)建針對(duì)性策略，預(yù)防窖泥菌群失調(diào)，維持窖泥菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定就有重要意義。

實(shí)驗(yàn)對(duì)新老窖泥中微生物組成結(jié)構(gòu)，以及對(duì)應(yīng)窖池的丁酸和己酸產(chǎn)生情況分析，初步明確了窖泥中主體的己酸菌為己酸菌屬微生物，而非傳統(tǒng)認(rèn)為的克氏棱菌。根據(jù)是否使用窖泥，我國(guó)白酒可以分為兩類，即有泥釀造與無(wú)泥釀造。鑒于有泥釀造工藝類型多種多樣，如濃香型采用全泥窖工藝，醬香型與芝麻香型采用泥底磚壁工藝，那么不同地區(qū)、不同釀造工藝下，己酸菌種類是否相同？由于對(duì)己酸菌種類的認(rèn)識(shí)與人工窖泥制作、窖泥養(yǎng)護(hù)、窖泥防退化息息相關(guān)，對(duì)窖泥中己酸菌種類的認(rèn)識(shí)值得進(jìn)行更為深入的研究。