張久旭，翟小林，王丹，裴紋萱，董玲，孫裕，宋學(xué)斌，陳建波*，王晶娟*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029；3.蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

當歸是傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根[1]，其作為傳統(tǒng)的藥食兩用品種，產(chǎn)銷量大，價格較高，經(jīng)常出現(xiàn)摻假混偽等問題。因此，建立快速準確的鑒別方法，實現(xiàn)全程質(zhì)量控制，對于保證當歸在藥用或者食用時的真實性、有效性和安全性都是非常必要的。2015年版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)規(guī)定了當歸粉末的顯微鑒別特征，包括薄壁細胞、導(dǎo)管和油室碎片。根據(jù)相關(guān)文獻，當歸粉末的顯微鑒別特征還包括淀粉粒和木栓細胞[2-3]?；诩毎徒M織形態(tài)特征的顯微鑒別法是中藥粉末鑒定的基本方法之一；但是，中藥粉末顯微鑒別主要以組織、細胞和細胞后含物的形狀、顏色等物理性質(zhì)為依據(jù)，這些顯微結(jié)構(gòu)的細節(jié)多變，難以建立客觀量化的識別規(guī)則，判斷標準比較模糊，鑒定結(jié)果非常依賴于操作者的知識經(jīng)驗和主觀判斷。因此，有必要發(fā)展更加客觀量化的顯微特征檢測技術(shù)。本研究即以衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)顯微成像技術(shù)為基礎(chǔ)，建立當歸粉末顯微鑒別特征的化學(xué)檢測方法，進一步提高當歸顯微鑒別方法的客觀性和準確性。

中藥粉末里很多顯微結(jié)構(gòu)的形狀、顏色等物理性質(zhì)可能具有多變的細節(jié)，但是其化學(xué)組成相對穩(wěn)定。例如，茯苓粉末里分枝狀團塊的具體形狀有很大差異，但主要都是由β-葡聚糖類成分組成[4]。因此，根據(jù)中藥粉末顯微結(jié)構(gòu)的化學(xué)特征對其進行識別，可以作為形態(tài)特征識別的補充方法，提高顯微鑒別法的客觀性和準確性。隨著儀器技術(shù)的進步，很多以光譜、能譜或質(zhì)譜為基礎(chǔ)的顯微化學(xué)分析技術(shù)不斷發(fā)展成熟并得到廣泛應(yīng)用。相比于其他方法，顯微紅外光譜在中藥顯微化學(xué)分析方面具有一些顯著的優(yōu)勢：首先，紅外光譜是直接、無損的分析技術(shù)，不需要分離提取或分子標記處理，容易與常規(guī)光學(xué)顯微分析相結(jié)合；其次，紅外光譜可以作為指紋圖譜同時反映樣本中全部成分的整體信息，而不是只檢測個別成分；再者，顯微紅外光譜可以達到微米級空間分辨率，而且具有很快的測試速度，能夠快速尋找到細胞或組織水平的特征顯微結(jié)構(gòu)。因此，顯微紅外光譜技術(shù)近年來已經(jīng)在中藥顯微化學(xué)分析方面得到越來越多的應(yīng)用[5-12]。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用當歸藥材樣品于2015年采集自甘肅漳縣(1號樣品)、岷縣(2號樣品)和渭源縣(3號樣品)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院王晶娟副教授鑒定為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根。當歸樣品粉碎后過60目篩，粉末直接進行紅外光譜測試。當歸揮發(fā)油提取按照2015版《中國藥典》四部通則2204揮發(fā)油測定法中的乙法進行。分析純蔗糖、淀粉、草酸鈣(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，藁本內(nèi)酯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111737)。

1.2 常規(guī)紅外光譜測試

常規(guī)紅外光譜測試所用儀器為PerkinElmer Frontier FT-IR/NIR光譜儀及其配套的UATR附件，DTGS檢測器。使用衰減全反射(ATR)方法測量樣品的紅外光譜，光譜測量范圍4000～650 cm-1，分辨率4 cm-1，每張光譜累加掃描16次，使用空氣作為光譜背景，掃描過程中自動扣除水蒸氣和二氧化碳干擾。樣品原始測量光譜經(jīng)過PerkinElmer Spectrum v10軟件的ATR校正、自動基線校正和歸一化處理后進行譜圖分析。

1.3 顯微紅外光譜測試

顯微紅外光譜測試使用PerkinElmer Frontier FT-IR/NIR光譜儀與PerkinElmer Spotlight 400 FT-IR Microscope所組成的紅外光譜顯微成像系統(tǒng)以及配套的ATR光譜成像附件進行，使用液氮冷卻的MCT線陣列檢測器。當歸樣品粉末直接放在不銹鋼底板上進行測試，單次測試區(qū)域500 μm×500 μm，像素尺寸6.25 μm×6.25 μm，光譜范圍4000～750 cm-1，光譜分辨率8 cm-1，每張光譜累加掃描8次，空白底板作為光譜背景。使用PerkinElmer Spectrum IMAGE v1.7軟件對原始測量光譜進行ATR校正和空氣背景校正，然后以2100～2000 cm-1區(qū)域為參考波段進行基線平移校正。顯微光譜的主成分分析使用Spectrum IMAGE軟件進行，偏最小二乘投影使用MATLAB 2016b軟件和自編程序進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 當歸藥材及其揮發(fā)油的體相紅外光譜分析

圖1所示為甘肅漳縣、岷縣和渭源縣所產(chǎn)3個當歸藥材樣品的體相紅外光譜。3個當歸藥材的紅外光譜特征比較一致，主要包括：3600～3000 cm-1區(qū)域的羥基O-H伸縮振動吸收峰、3000～2800 cm-1區(qū)域的C-H伸縮振動吸收峰、1750 cm-1附近的羰基C=O伸縮振動吸收峰、1640 cm-1附近的疊加峰(蛋白質(zhì)酰胺I帶、羥基O-H彎曲振動吸收峰、芳環(huán)骨架振動吸收峰等)、1515 cm-1附近的芳環(huán)骨架振動吸收峰、1300～900 cm-1區(qū)域的疊加峰(C-O伸縮振動峰、O-H彎曲振動峰、糖環(huán)骨架振動峰等)[13-14]?？梢钥吹?，3600～3000 cm-1區(qū)域和1400～800 cm-1區(qū)域的當歸藥材紅外光譜與結(jié)晶態(tài)蔗糖非常相似，說明當歸藥材中含有大量的結(jié)晶態(tài)蔗糖。由于蔗糖和其他成分吸收信號的疊加，在當歸藥材的紅外光譜上難以直接觀察到揮發(fā)油類成分的特征吸收峰。

注：A.當歸樣品1；B.當歸樣品2；C.當歸樣品3；D.蔗糖。圖1 當歸粉末的體相紅外光譜

圖2所示為甘肅漳縣、岷縣和渭源縣所產(chǎn)3個當歸藥材樣品揮發(fā)油的體相紅外光譜。3個當歸藥材揮發(fā)油的紅外光譜特征比較一致，主要包括：3100～2800 cm-1區(qū)域的C-H伸縮振動吸收峰、1760 cm-1附近的羰基C=O伸縮振動吸收峰、1700～1550 cm-1區(qū)域的雙鍵C=C伸縮振動吸收峰、1515 cm-1附近的芳環(huán)骨架振動吸收峰、1500～1350 cm-1區(qū)域的C-H彎曲振動吸收峰、1300～900 cm-1區(qū)域的疊加峰(C-O伸縮振動峰、O-H彎曲振動峰等)[13-14]。可以看到，當歸藥材揮發(fā)油的紅外光譜特征與藁本內(nèi)酯非常相似，說明當歸藥材揮發(fā)油中含有大量的藁本內(nèi)酯[15]。另外，1515 cm-1附近的芳環(huán)骨架振動吸收峰說明當歸藥材揮發(fā)油中含有一些芳香類成分，與藁本內(nèi)酯不同。

注：A.當歸樣品1揮發(fā)油；B.當歸樣品2揮發(fā)油；C.當歸樣品3揮發(fā)油；D.藁本內(nèi)酯。圖2 當歸揮發(fā)油的體相紅外光譜

像素1的光譜信號中包含1757 cm-1等揮發(fā)油的特征峰，說明該類像素可能對應(yīng)于油室碎片。像素2的光譜信號與淀粉基本一致，說明其對應(yīng)于淀粉粒。像素3的光譜信號與蔗糖基本一致，這些蔗糖可能存在于薄壁細胞中。像素4的光譜信號中包含1624 cm-1和1308 cm-1處的草酸鈣特征峰，說明該類像素可能對應(yīng)于草酸鈣晶體。像素5的光譜信號比較復(fù)雜，2921、2852、1738 cm-1等吸收峰可能來自角質(zhì)層，1513 cm-1處是芳香類成分吸收峰，該類像素可能對應(yīng)于細胞壁類結(jié)構(gòu)，但是難以確定是哪種類型的細胞。

2.2 當歸藥材粉末顯微紅外光譜成像的非靶向分析

當歸藥材粉末的體相紅外光譜反映的是所有化學(xué)成分的整體吸收信號，因此難以直接觀察到一些特定的結(jié)構(gòu)或成分特征吸收信號。當歸藥材粉末具有多種微觀結(jié)構(gòu)，也就是說其化學(xué)成分的空間分布是不均勻的。通過顯微紅外光譜成像技術(shù)對當歸藥材粉末的大量微區(qū)(每個微區(qū)稱為一個像素)進行測試，使用一定的化學(xué)計量學(xué)方法對光譜數(shù)據(jù)進行解析，可以獲得某些特定成分光譜信號及其空間分布信息，了解特定顯微結(jié)構(gòu)的化學(xué)組成。圖3所示漳縣所產(chǎn)當歸樣品粉末的ATR-FTIR顯微光譜成像主成分分析結(jié)果，是根據(jù)不同像素顯微紅外光譜前3個主成分得分而生成的贗彩色圖像。具有相似光譜特征的像素在不同主成分上的得分接近，因而在贗彩色圖像上具有相似的顏色。從圖3中可以看出，當歸藥材粉末中存在多種類型的像素，一些代表性的像素光譜(其空間位置標注在圖3中)如圖4所示。

圖3 當歸樣品1粉末ATR-FTIR顯微光譜成像主成分分析結(jié)果

圖4 當歸樣品1粉末ATR-FTIR顯微光譜成像典型像素光譜

2.3 當歸藥材粉末顯微紅外光譜成像的靶向檢測

根據(jù)前面的結(jié)果分析可知，當歸藥材粉末的顯微紅外光譜圖像中包含揮發(fā)油、淀粉、蔗糖、草酸鈣和細胞壁等幾類微觀結(jié)構(gòu)。因此，可以使用靶向檢測的方法，在當歸藥材粉末中定向?qū)ふ疫@些顯微光譜特征。從圖4顯示的像素光譜可知，單個像素光譜通常不能等同于單一化學(xué)成分，總是或多或少存在其他成分的干擾信號。因此，在當歸藥材粉末中靶向檢測特征顯微光譜信號時，需要使用對未知背景信號具有較強抗干擾能力的算法。本研究使用偏最小二乘投影法[16]，在當歸藥材粉末的顯微紅外光譜圖像中尋找揮發(fā)油、淀粉、蔗糖和草酸鈣的特征信號較強的像素。不同類型細胞的細胞壁成分具有差異，在尚未確定特定類型細胞壁特征吸收信號的狀態(tài)下，本研究暫不將細胞壁作為目標檢測信號之一。

圖5所示為甘肅漳縣、岷縣和渭源縣所產(chǎn)3個當歸藥材粉末ATR-FTIR顯微光譜成像的特征信號靶向檢測結(jié)果，是目標光譜投影值最高的像素光譜。3個樣品中均能順利找出具有揮發(fā)油、淀粉、蔗糖和草酸鈣特征吸收信號的像素光譜，說明這些光譜信號作為當歸藥材粉末的顯微紅外光譜鑒定特征是可行的。

注：A1～A4.當歸樣品1；B1～B4.當歸樣品2；C1～C4.當歸樣品3。圖5 當歸粉末ATR-FTIR顯微光譜特征靶向檢測結(jié)果

3 結(jié)論

紅外光譜用于中藥質(zhì)量評價的根本優(yōu)勢在于直接無損，樣品不需要進行分離提取或衍生化等分子標記處理，可以顯著地節(jié)省檢測過程的人力、物力、時間、化學(xué)品消耗。但是，中藥樣品不經(jīng)分離而直接進行紅外光譜測試時，樣品中各種成分的吸收信號疊加在一起，弱吸收信號被強吸收信號所掩蓋，難以找出微量成分的特征信號。本研究的結(jié)果說明，使用顯微紅外光譜成像技術(shù)對中藥粉末進行表征，可以將顯微物理結(jié)構(gòu)與顯微化學(xué)成分相結(jié)合，以物理分離代替化學(xué)分離而實現(xiàn)微量成分信息的挖掘。

根據(jù)中藥粉末顯微結(jié)構(gòu)的化學(xué)特征對其進行識別，可以作為形態(tài)特征識別的補充方法，提高顯微鑒別法的客觀性和準確性。使用ATR-FTIR顯微光譜成像技術(shù)檢測其中的揮發(fā)油、淀粉、蔗糖和草酸鈣特征吸收信號，可以作為當歸藥材粉末的光譜顯微鑒別特征，為當歸的質(zhì)量控制提供一種有效的檢測方法。