魏金銷，張 月，方 芳，譚旭信，郭宏文，郭利亞，張曉建，安小鵬，曹斌云，白躍宇,,5*

(1.河南省種牛遺傳性能測定中心，河南 鄭州 450046；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.河南省畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，河南 鄭州 450008；4.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；5.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鄭州 450008)

卵巢作為雌性動物的重要繁殖器官，能夠直接決定繁殖性能的高低。在卵泡發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞體積不斷增大并逐步發(fā)育成熟，伴隨這一過程的還有圍繞它周圍的顆粒細(xì)胞的增殖和分化。卵巢顆粒細(xì)胞是卵巢中的一種重要體細(xì)胞，它的生長發(fā)育受錯綜復(fù)雜的細(xì)胞信號系統(tǒng)調(diào)控，在促性腺激素等的調(diào)控下對卵泡發(fā)育有重要影響。目前研究表明許多卵巢外和卵巢內(nèi)的因子參與了這一卵泡發(fā)育調(diào)控過程，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neuotrophic factor, BDNF)等[12]。

成熟的MicroRNAs (miRNAs)是一類長約20～24 nt的非編碼單鏈RNA分子，主要通過轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控方式抑制或促進(jìn)基因表達(dá)[1]。miRNAs的作用機(jī)制主要有3種，即翻譯起始抑制[2]、翻譯起始后抑制[3-5]和靶mRNA降解[6-7]。在動物中，miRNAs結(jié)合位點(diǎn)通常位于靶mRNA的3'UTR區(qū)[8-9]。miRNAs主要通過與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)不完全配對結(jié)合，調(diào)控許多生物學(xué)過程。大量研究表明miRNAs對動物卵巢、輸卵管、子宮等與繁殖相關(guān)的組織器官的生長發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用[10-11]。

繼神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)發(fā)現(xiàn)后，Barde等[12]從豬腦中分離純化到了第二種神經(jīng)營養(yǎng)因子，即腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。BDNF與NGF、神經(jīng)營養(yǎng)素-3 (neurotroph-3, NT-3)、NT4/5、NT-6和NT-7等同屬于神經(jīng)生長因子家族，又稱神經(jīng)營養(yǎng)素 (Neurotrophins, NTs)[13]。眾所周知，BDNF調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)元、小腦神經(jīng)元及髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的存活和分化，對神經(jīng)元的生長、分化和存活具有重要作用[14]。最近的研究表明，BDNF也在心血管、免疫、內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)等非神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，BDNF及其受體在各發(fā)育時期的卵泡中也被發(fā)現(xiàn)，說明BDNF對除神經(jīng)細(xì)胞以外的細(xì)胞也具有作用[15]。

越來越多的研究證明BDNF有助于卵泡發(fā)育，如促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖以及原始卵泡的生長，維持間質(zhì)細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)促卵泡素受體(FSHR)的產(chǎn)生[16]。BDNF及其受體酪氨酸蛋白激酶B(TrkB)可能是聯(lián)系卵泡形成時卵母細(xì)胞與卵泡顆粒細(xì)胞的一種信號分子。Ojeda等[17]利用基因敲除方法研究BDNF對大鼠卵泡發(fā)育的影響，首次證明了BDNF及TrkB表達(dá)于人初級卵泡和次級卵泡的顆粒細(xì)胞，說明BDNF在早期卵泡的生成和發(fā)育中具有重要作用。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b通過轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控方式調(diào)節(jié)BDNF基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的生長、分化以及細(xì)胞間的相互作用而影響早期卵泡的發(fā)育。

本研究擬從建立的多羔(3～5只)和單羔奶山羊發(fā)情期卵巢組織差異表達(dá)microRNA文庫中篩選出差異表達(dá)顯著的miR-10b，并利用生物信息學(xué)和實(shí)時定量PCR等技術(shù)研究miR-10b對BDNF的表達(dá)和卵巢顆粒細(xì)胞活性的影響，為提高奶山羊產(chǎn)羔率提供試驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

本試驗所用的奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞采自楊凌屠宰場，新鮮屠宰的奶山羊卵巢組織浸入PBS中，在2 h之內(nèi)帶回試驗室處理。pRL-TK載體由實(shí)驗室保存，pGL3-Control載體購自美國Promega公司，pMDTM19-T Vector購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試劑及儀器

PCR試劑(Biotake公司)、miR-10b mimics和miR-10b control(廣州銳博生物科技有限公司)、雙熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)、DMEM/F12、Opti-MEM○RI、胎牛血清(Gibco公司)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)(PeppoTECH公司)、二甲基亞砜 (DMSO)、胰蛋白酶(Hyclone公司)、LipofectamineTM2000、青-鏈霉素、Real Time PCR試劑盒(上海Invitrogen公司)、一抗Rabbit Anti-FSHR(北京博奧森公司)、SABC-cy3兔免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)、核酸染料(百泰克(北京)生物技術(shù)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑(RNAiso Plus)、XbaⅠ內(nèi)切酶(Takara公司)、普通質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、蛋白胨、酵母提取物、IPTG和X-gal和瓊脂粉(Agar)(生工生物工程(上海)有限公司)、DNA marker(康為世紀(jì)生化科技有限公司)、瓊脂糖(美國HydraGene公司)。

主要儀器有PCR擴(kuò)增儀(96 Well，ABI公司)、實(shí)時定量儀(Bio-rad公司)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo forma)、倒置顯微鏡(Nikon)、多標(biāo)記微孔板檢測儀(PerkinElmer)、常溫高速離心機(jī)(Eppendorf)、低溫冷凍離心機(jī)(Beckman)、凝膠成像儀(百晶生物)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一)、恒溫培養(yǎng)振蕩器(SUNKUN公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 miR-10b的差異表達(dá)與靶基因的預(yù)測 差異表達(dá)miRNAs文庫和實(shí)時定量PCR驗證由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司完成。利用Targetscan(http://www.targetscan.org/index.html)、RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)、Mirnaviewe (http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl)和Pictar (http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/new)等在線預(yù)測軟件對小鼠miR-10b靶基因進(jìn)行預(yù)測。

由表6可知，飼喂復(fù)方阿膠漿藥渣對驢心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、胰臟指數(shù)及腸指數(shù)均沒有顯著影響（P＞0.05)；但驢胃指數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05)；脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均有明顯增加趨勢（0.05＜P＜0.1)。

1.3.2BDNF3'UTR片段的克隆與BDNF3'UTR熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中牛BDNFmRNA全序列( GenBank號: NM_001046607) ，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增BDNF3 'UTR全長，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 7.5 μL，靶基因上、下游引物各0.5 μL，cDNA 50 ng，DNAase-free dH2O到15 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；35個循環(huán)(94 ℃ 35 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)；72 ℃延伸10 min。取2 μL回收的PCR產(chǎn)物和1 μL pMDTM19-T Vector按照說明書與5 μl Solution Ⅰ和2 μL dH2O混成10 μL體系。16 ℃連接30 min后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板。37 ℃培養(yǎng)14 h后，挑取單克隆搖菌，通過菌液PCR鑒定并送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果用DNAstar軟件和Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast)分析，驗證片段的正確性。

利用XbaⅠ內(nèi)切酶分別對提取得到的pGL3-control載體和pMD 19-3'UTR進(jìn)行酶切。酶切體系：1 μLXbaⅠ、2 μL 0.1% BSA、2 μL 10×M Buffer、1 μL DNA和9 μL ddH2O，37 ℃恒溫酶切3 h，膠回收。分別取10 μL目的片段、2 μL報告質(zhì)粒回收產(chǎn)物、1 μL T4 DNA Ligase、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer和ddH2O混成20 μL體系，16 ℃連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板，PCR、測序鑒定陽性克隆。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10% 胎牛血清的DMEM高糖生長培養(yǎng)基在37 ℃、 5% CO2的條件培養(yǎng)奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞。及時檢查細(xì)胞貼壁和生長情況，每24 h更換培養(yǎng)液。將GCs以5×105的接種量接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度達(dá)到50%。 按照lipofectamineTM2000說明書，用50 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM○RⅠ分別稀釋pGL3-BDNF 3'UTR、pRL-TK、miRNA mimics/NC和脂質(zhì)體，混勻靜置5 min后，將二者混勻，靜置 20 min后，將轉(zhuǎn)染混合物均勻滴加到細(xì)胞中，4～6 h后換生長培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～96 h。

1.3.4 總RNA提取及實(shí)時定量PCR 吸去培養(yǎng)基后用PBS洗去死細(xì)胞；每10 cm生長的培養(yǎng)細(xì)胞加入1 mL RNAiso Plus，靜置5 min；吸至1.5 mL的離心管；加入RNAiso Plus 1/5體積量的氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置15 min；4 ℃、 12 000 r/min離心15 min；吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入75%的乙醇1 mL，4 ℃、12 000 r/min離心5 min去乙醇；用RNAase-free溶解RNA，測定濃度，-80 ℃ 保存。 microRNA特異性反轉(zhuǎn)錄：10 μL 2 × miRNA Reaction Buffer Mix、2 μL 0.1% BSA、2 μL miRNA PrimeScript Enzyme Mix、1 μL Total RNA和5 μL RNase-Free H2O混合進(jìn)行特異性反轉(zhuǎn)錄。基因反轉(zhuǎn)錄依照說明書操作。反應(yīng)條件為95 ℃ 60 min；85 ℃ 5 s。實(shí)時定量PCR分析：microRNA的反應(yīng)以U6為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；40個循環(huán)(95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s)；溶解曲線設(shè)置為55 ℃到95 ℃。BDNF基因以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；40個循環(huán) (95 ℃ 5 s；60℃ 30 s；72℃ 15 s)；溶解曲線設(shè)置為55 ℃到95 ℃。實(shí)時定量引物見表2。

表1 BDNF基因 3 'UTR克隆的引物信息

表2 實(shí)時定量PCR的引物信息

1.3.5 熒光素酶活性檢測 GCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗，加入100 μL 1×Passive Lysis Buffer，室溫?fù)u床上孵育15 min充分裂解細(xì)胞；吸取細(xì)胞裂解液至酶標(biāo)板，分別先后加入100 μL熒光素酶測試試劑Ⅱ (LARⅡ)和 Stop&Glo試劑，并立即檢測海腎熒光素酶的活性，測量時，使用1～2 s延遲和5～10 s讀數(shù)。海腎熒光與螢火蟲熒光比值即為相對熒光素酶活性。

1.3.5 顆粒細(xì)胞活性試驗(MTT) 將GCs以1×105的接種量接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度達(dá)到50%。轉(zhuǎn)染miRNA的培養(yǎng)板里第1組為空白對照，第2～6組轉(zhuǎn)染miR-10b mimics，濃度分別為10、30、50和100 nmol/L，轉(zhuǎn)染BDNF因子的培養(yǎng)板里第1組為空白對照，第2～6組培養(yǎng)液中分別添加BDNF因子濃度為10、20、40、60 μg/L的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h處理細(xì)胞，并檢測吸光值。每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后終止培養(yǎng)，吸去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，在490 nm波長處測定吸光值。計算公式：相對細(xì)胞活性=(轉(zhuǎn)染組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素方差分析不同處理組的差異(BDNFmRNA的表達(dá)量，miR-10b表達(dá)量，熒光素酶表達(dá)量，細(xì)胞活性率)，t檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-10b的差異表達(dá)

2.2 miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果與BDNF 3'UTR的 RCR擴(kuò)增

隨機(jī)選取3組擴(kuò)增得到的樣品，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增條帶清晰，大小符合目的片段。將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，比對結(jié)果表明克隆正確。

圖1 miR-10b在多羔和單羔奶山羊卵巢組織中的差異表達(dá)
*P<0.05,**P<0.01。下圖同

Fig.1 Differential expression of miR-10b in polytocous and monotocous dairy goats
*P<0.05，**P<0.01.The same below

圖2 BDNF基因3'UTR區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果1～3. PCR產(chǎn)物；M. MarkerⅠ

2.3 pGL3-BDNF 3'UTR載體酶切鑒定結(jié)果

將重組載體進(jìn)行酶切鑒定，得到兩個片段，其中小片段大小為257 bp，符合預(yù)期結(jié)果，而對照組單酶切結(jié)果只有一個片段(圖3)。重組載體測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，結(jié)果說明載體構(gòu)建成功。

2.4 熒光素酶活性檢測

經(jīng)過SPSS軟件分析可知，共轉(zhuǎn)染pGL3-BDNF

3'UTR和miR-10b mimics，熒光素酶相對表達(dá)量極顯著低于空白對照組，轉(zhuǎn)染pGL3-BDNF 3'UTR和miR-10b mimics control，熒光素酶表達(dá)量與空白對照沒有顯著差異(圖4)，結(jié)果說明miR-10b可能作用于重組載體3'UTR區(qū)，即miR-10b作用于靶基因BDNF的3'UTR，導(dǎo)致熒光素酶表達(dá)量顯著下降。初步確定BDNF為miR-10b的靶基因。

圖3重組載體酶切鑒定
1.對照；2.重組載體；M1.DNA Marker Ⅲ；M2.250 bp Ladder

Fig.3 Enzyme digestion analysis on the recombination vector
1. Control;2. Recombination vector;M1. DNA Marker Ⅲ; M2. 250 bp Ladder

圖4熒光素酶相對表達(dá)量

Fig.4 Relative expression of luciferase

2.5 實(shí)時定量PCR檢測靶基因mRNA表達(dá)水平

實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-10b mimics后在顆粒細(xì)胞中檢測到miR-10b表達(dá)量是對照組的約40倍，說明顆粒細(xì)胞中miR-10b表達(dá)水平很高(圖5a)；由圖5b可見, 轉(zhuǎn)染miR-10b mimics后BDNFmRNA表達(dá)量及顯著低于對照組(P<0.01)。由此可以說明，高水平的miR-10b抑制了BDNF的表達(dá)，可能是通過降解BDNFmRNA而實(shí)現(xiàn)該過程。

2.6 miR-10b對顆粒細(xì)胞活性的影響

向顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b mimics后細(xì)胞的相對活性見圖6。培養(yǎng)24 h后，miR-10b mimics處理組與對照組細(xì)胞相對活性沒有顯著變化；培養(yǎng)48 和72 h后，所有50、100 nmol/L處理組細(xì)胞的相對活性極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)低于對照組。過表達(dá)miR-10b可以抑制顆粒細(xì)胞的活性，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L。

圖5 實(shí)時定量PCR結(jié)果a. miR-10b的相對表達(dá)量；b. BDNF的相對表達(dá)量

圖6 miR-10b對顆粒細(xì)胞活性的影響A. Control; B, C, D, E.10, 30, 50, 100 nmol/L

2.7 BDNF因子對顆粒細(xì)胞活性的影響

由圖7知，培養(yǎng)24 h后，20 μg/L以上BDNF因子處理組細(xì)胞的相對活性顯著高于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)48 h后，所有BDNF因子處理組細(xì)胞的相對活性均顯著高于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)72 h后，BDNF因子處理組與對照組相比沒有顯著變化(P>0.05)。

2.8 BDNF因子和miR-10b對顆粒細(xì)胞活性的影響

根據(jù)前兩個試驗結(jié)果，加入外源性BDNF因子(20 μg/L)的同時轉(zhuǎn)染miR-10b mimics(100 nM)，分別在24 h、48 h和72 h后測定吸光值，計算細(xì)胞的相對活性。由圖8可知，培養(yǎng)24 h和48 h后，BDNF因子處理組細(xì)胞的相對活性顯著高于對照組(P<0.05)，而高水平的miR-10b抵消了BDNF因子對顆粒細(xì)胞活性的促進(jìn)作用；培養(yǎng)72 h后，BDNF處理組細(xì)胞的相對活性與對照組相比沒有顯著提高，說明BDNF對顆粒細(xì)胞活性的促進(jìn)有時間效應(yīng)。以上結(jié)果表明，高水平的miR-10b可抑制BDNF促進(jìn)顆粒細(xì)胞活性的作用，結(jié)合實(shí)時定量PCR結(jié)果可知，miR-10b可能通過調(diào)節(jié)BDNF基因的表達(dá)抑制顆粒細(xì)胞的活性。

圖7 BDNF因子對顆粒細(xì)胞活性的影響A. Control; B, C, D, E. 10, 20, 40, 60 μg/L

圖8 顆粒細(xì)胞的相對活性A. Control; B. miR-10b; C.BNDF; D. BNDF+miR-10b

3 討 論

顆粒細(xì)胞的增殖、分化是卵泡發(fā)育中的一項重要過程，卵巢發(fā)育關(guān)鍵基因促卵泡素受體(Follicle Stimulating Hormone Receptor，F(xiàn)SHR)就是在顆粒細(xì)胞中表達(dá)的[18]。顆粒細(xì)胞還能合成很多活性肽，如抑制素(Inhibin)[19]、激活素(activin)[20]、卵泡抑素(follistatin)[21]，這些蛋白不僅可以調(diào)節(jié)FSH的釋放，還可以作為調(diào)節(jié)因子直接參與卵泡發(fā)育過程。在排卵過程中，顆粒細(xì)胞可以介導(dǎo)調(diào)節(jié)促黃體生成素(LH)的分泌，從而調(diào)控排卵過程[22]。在卵泡閉鎖現(xiàn)象出現(xiàn)時，顆粒細(xì)胞也承擔(dān)著必不可少的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞的凋亡可以直接導(dǎo)致卵泡閉鎖[23]。如果發(fā)育中的卵泡周圍的顆粒細(xì)胞有10%以上出現(xiàn)了凋亡，那么這個卵泡可能正在或者已經(jīng)閉鎖，而卵泡發(fā)生閉鎖之后，就不能正常發(fā)育。

顆粒細(xì)胞與卵泡發(fā)育有著緊密的聯(lián)系。然而，顆粒細(xì)胞究竟如何調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的機(jī)制還不是很清楚，仍需要學(xué)者們?nèi)パ芯刻剿?。所以，研究顆粒細(xì)胞活性的調(diào)控機(jī)理，對促進(jìn)卵泡發(fā)育、抑制卵泡閉鎖等生物學(xué)過程具有重要意義。很多研究證明神經(jīng)生長因子家族成員能夠調(diào)節(jié)卵巢和生殖細(xì)胞的發(fā)育，如促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的活性，加快初級卵泡的發(fā)育，促進(jìn)初級卵泡中顆粒細(xì)胞的擴(kuò)散等[24]。越來越多的研究證明，BDNF在生殖系統(tǒng)中具有重要作用。Dissen等[16]證實(shí)，BDNF有助于卵泡的發(fā)育，如促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的活性以及原始卵泡的生長。BDNF及其受體TrkB可能作為聯(lián)系卵泡形成時卵母細(xì)胞與卵泡顆粒細(xì)胞的一種信號分子。Ojeda等[17]首次證明了BDNF及其受體TrkB表達(dá)于人初級卵泡和次級卵泡的顆粒細(xì)胞中，推測BDNF及其受體TrkB在人卵泡發(fā)育早期就參與了卵泡發(fā)育的調(diào)控。Harel[25]研究發(fā)現(xiàn)，BDNF和TrkB在人卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞都有表達(dá)，說明BDNF可能通過調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的生長、分化以及細(xì)胞間的相互作用而影響早期卵泡的發(fā)育的。目前很多研究者主要研究miR-10b在腫瘤組織或癌細(xì)胞中的功能作用，有關(guān)miR-10b參與調(diào)控卵巢細(xì)胞活性的報道非常少。本試驗初次研究miR-10b及其靶基因BDNF在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)以及對體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞活性的調(diào)控作用。

易康樂等[26]用BDNF因子處理體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中加入20 μg/L的BDNF因子可顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。本試驗中觀察到，在培養(yǎng)液中添加適宜濃度(20μg/L、40μg/L和60μg/L)的BDNF因子可以促進(jìn)奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞的活性，表明BDNF是重要的卵泡調(diào)節(jié)因子。然而，過表達(dá)miR-10b則會抑制顆粒細(xì)胞活性，表明miR-10b也具有重要的卵泡調(diào)節(jié)作用。在培養(yǎng)液中添加適宜濃度的BDNF因子的同時過表達(dá)miR-10b，顆粒細(xì)胞活性沒有明顯的變化，結(jié)合miR-10b靶基因驗證結(jié)果，推測高水平的miR-10b抑制了BDNF因子對顆粒細(xì)胞活性的促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果顯示，miR-10b是通過抑制BDNF基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對卵巢顆粒細(xì)胞活性的抑制作用，與易康樂等[26]研究結(jié)果相符，而miR-10b作為調(diào)節(jié)BDNF基因的重要分子為研究奶山羊育種提供了新思路。本試驗結(jié)果為進(jìn)一步研究miR-10b在卵泡發(fā)育中的功能和作用機(jī)理提供了試驗依據(jù)，對于提高奶山羊的產(chǎn)羔率具有重要意義。

4 結(jié) 論

miR-10b在單羔奶山羊卵巢組織中的相對表達(dá)量顯著高于多羔奶山羊卵巢組織中的相對表達(dá)量。熒光素酶報告載體和實(shí)時定量PCR驗證BDNF是miR-10b的靶基因。通過添加外源性BDNF因子可顯著促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的活性，而高水平的miR-10b則顯著抑制了BDNF因子對顆粒細(xì)胞活性的促進(jìn)作用。